Détection des réponses physiologiques des neurones sensoriels chez la drosophile

Fixez une Drosophila melanogaster génétiquement modifiée anesthésiée sur le côté à une lamelle.

Étendez ses pattes antérieures et fixez-les pour exposer les segments tarsiens.

Ces segments ont des neurones gustatifs exprimant des complexes indicateurs de calcium qui deviennent fluorescents sous forme liée au calcium.

Tirez une barrière hydrophobe autour de la mouche pour retenir la solution.

Laissez la mouche récupérer et superposez une solution saline tamponnée sur les segments de tarse exposés pour les humidifier.

Sous un microscope confocal, observez les segments tarsiens et imagez les neurones gustatifs à différentes profondeurs pour obtenir une fluorescence de pré-stimulation.

Ajoutez une solution de stimulation contenant des ligands lipophiles sur le segment.

Ces ligands se lient aux récepteurs gustatifs des neurones, initiant des voies de signalisation et déclenchant l’ouverture des canaux calciques.

Cela permet aux ions calcium du liquide extracellulaire de pénétrer dans le cytoplasme et de se lier aux complexes indicateurs de calcium, ce qui entraîne une émission de fluorescence.

Lorsqu’elle est observée à nouveau, une augmentation de la fluorescence neuronale confirme la réponse physiologique neuronale au ligand.

Après avoir anesthésié la mouche, fixez-la à une lamelle de 0,17 millimètre, à l’aide d’une très petite goutte de vernis à ongles transparent. Fixez le côté de la braguette à la diapositive en utilisant toute la goutte. Ensuite, sous un microscope à dissection, utilisez un pinceau humide pour étendre une patte avant de la mouche. Ensuite, à l’aide de deux bandes très fines de ruban adhésif, fixez les premier et cinquième segments tarsiens à la lamelle.

Si les neurones de la trompe doivent être imagés, placez une autre fine bande de ruban adhésif sur le rostre de la trompe pour exposer le labelle. Maintenant, faites un petit mur autour de la mouche à l’aide d’un stylo PAP. Laissez l’anesthésie se dissiper pendant une demi-heure avant de prendre les mesures. Pour ce protocole, préparez les dilutions nécessaires de la solution mère de ligand de 1 milligramme par millilitre à l’aide de PBST.

Pour commencer la procédure, superposez 10 microlitres de PBST sur les segments tarsiens sécurisés et exposés. Cela humidifie la jambe et l’empêche de devenir floue. Ensuite, concentrez-vous sur les segments à l’aide d’un système optique capable d’obtenir un bon signal de fluorescence avec une résolution temporelle rapide, tel qu’un microscope confocal à disque rotatif avec une caméra sCMOS. Collectez trois empilements Z de pré-stimulation des neurones d’intérêt dans le segment tarsien.

Dans cet exemple, les images sont capturées avec des expositions de 200 millisecondes et un binning 2 par 2 sur une section de 6 microns par 1/2 micron toutes les deux secondes. Assurez-vous d’optimiser la puissance du laser pour minimiser le photoblanchiment, tout en permettant un rapport signal/bruit élevé. Ici, un laser de 491 nanomètres et 100 milliwatts fonctionne à 30 % de transmission.

Le signal doit être détectable avant la stimulation, mais ne doit pas approcher la saturation. Maintenant, pipetez 10 microlitres de solution de stimulation sur le segment tarsien d’intérêt. Pendant le pipetage, faites très attention à ne pas toucher la patte ou le corps de la mouche, sinon les tarses se déplaceront hors de leur position. Ensuite, acquérez immédiatement les premières images post-stimulation et continuez à collecter suffisamment d’images pour documenter le changement maximal de fluorescence.