Enregistrement électrophysiologique optogénétique de cellules avec des canaux ioniques dépendants de la lumière

Placez une lamelle contenant des cellules rénales embryonnaires exprimant des canaux ioniques dépendants de la lumière et une protéine rapporteure fluorescente sur une chambre de mesure appliquée au silicium. Fermez-le et ajoutez un tampon externe.

Placez cette chambre sous un microscope. Placez une électrode de bain remplie d’agar. Perfuser avec un tampon pour éliminer les milieux résiduels et les cellules mortes.

À l’aide d’un filtre de fluorescence, identifiez et concentrez-vous sur la cellule cible.

Fixez une pipette patch à un micromanipulateur. Appliquez une pression pour éviter le colmatage et approchez-vous de la cellule.

Positionnez la pipette près de la cellule et relâchez la pression positive pour former un patch membranaire à l’extrémité.

Après avoir formé le patch de membrane, appliquez une pression négative pour rompre la membrane.

Appliquez une lumière d’une longueur d’onde spécifique pour ouvrir les canaux ioniques. Le mouvement des ions est enregistré sous forme de changement de tension par l’électrode.

Pour commencer, scellez la chambre de mesure avec du silicone pour éviter les fuites du tampon externe. Ensuite, placez une lamelle dans la chambre et fermez-la. Remplissez soigneusement la chambre avec un tampon extracellulaire pour éviter que les cellules ne se détachent. Ensuite, placez la chambre de mesure sous le microscope à l’aide de l’objectif 40x pour la visualisation des cellules.

Ensuite, placez un pont en gélose sur l’électrode du bain et placez-le dans la chambre avec le capteur de niveau de liquide et la sortie de perfusion du manipulateur de bain. Remplacez la solution extracellulaire deux fois par 1 millilitre de solution externe fraîche pour éliminer le milieu de culture résiduel et les cellules détachées. Faites la mise au point sur les cellules et recherchez une cellule transfectée, qui doit être isolée des autres cellules. Ensuite, utilisez un ensemble de filtres à trois bandes et une lumière orange pour exciter et visualiser mCherry.

Montez la pipette sur le support de pipette et appliquez une pression positive pour éviter le colmatage de la pointe. Localisez l’extrémité de la pipette patch sous le microscope et faites-la naviguer près de la cellule à l’aide du micromanipulateur.

Dans le logiciel d’acquisition de données, démarrez le test de membrane en mode Bain et appliquez un pas de tension. Vérifiez si la résistance de la pipette se situe dans la plage souhaitée de 1,3 à 3,0 mégaohms. Ensuite, mettez à zéro les courants de décalage et ajustez le potentiel de la pipette en tournant le bouton de décalage de la pipette sur l’amplificateur.

Pour établir un patch dans la configuration de la cellule entière, approchez-vous lentement de la cellule avec la pipette patch par le haut et relâchez la pression positive juste avant de toucher la cellule. Compensez la capacité de la pipette en tournant le bouton de compensation de capacité de la pipette pour obtenir une réponse plate de l’impulsion de test.

Basculez le test de membrane en mode cellulaire. Ensuite, rompez le patch sans détruire le joint en appliquant de courtes impulsions de pression négative ou de pression négative avec une force croissante pour obtenir une conformation de cellule entière.

Démarrez la compensation de résistance en série en réglant les deux paramètres de la cellule entière, la capacité de la cellule et la résistance en série. Enregistrez les courants induits par la lumière à différents potentiels de maintien. Cette figure montre que lors de l’éclairage avec une lumière verte, PSACR1 présente un courant transitoire rapide qui décroît rapidement jusqu’à un niveau de courant stationnaire.