Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 2:50 min • July 8th, 2025
Placez une culture de corps cellulaires sensoriels de l’oreille interne dans une chambre d’enregistrement.
Remplissez une pipette patch-clamp avec une solution interne.
Remplissez avec la même solution contenant un antibiotique perforant la membrane, ce qui lui permet d’atteindre progressivement la pointe.
Remplissez les deux tiers de la pipette avec la solution d’antibiotique, insérez-la dans un support contenant une électrode d’enregistrement et descendez-la dans la chambre.
Visualisez au microscope pour approcher un neurone.
Lorsque la pointe de la pipette entre en contact avec le neurone, la surface neuronale forme une fossette et la résistance augmente.
Appliquez une pression négative pour former un joint étanche entre la pipette et la membrane.
Maintenir le potentiel de rétention près du potentiel de membrane au repos.
L’antibiotique perfore la membrane, permettant le mouvement des ions entre la cellule et l’électrode pour établir un environnement ionique stable.
Appliquez des paliers de tension pour ouvrir des canaux ioniques voltage-dépendants, permettant l’afflux d’ions et générant des courants proportionnels à la fonction du canal ionique, qui sont enregistrés par l’électrode.
Trempez la pointe de la pipette dans la solution propre de la boîte de culture, pour la remplir d’une solution propre qui ne contient pas d’amphotéricine. Remplissez le dos de la pipette avec la solution interne contenant de l’amphotéricine. Retrempez l’extrémité de la pipette dans la solution propre de la boîte de culture tandis que l’amphotéricine pénètre lentement dans l’extrémité par l’arrière de la pipette. Ensuite, terminez de remplir la pipette avec la solution d’amphotéricine jusqu’aux 2/3 de la pipette.
Abaissez la pipette dans le bain de la chambre d’enregistrement et placez la pointe de la pipette au milieu du champ de vision. Assurez-vous que la pointe est exempte de bulles d’air ou d’autres débris. Positionnez la pipette près de la membrane et posez-la fermement au centre de la cellule. Appliquez une pression négative ou une aspiration à l’aide d’une seringue ou d’une pipette buccale.
Activez le potentiel de maintien de moins 60 millivolts. La résistance du joint doit augmenter jusqu’à ce qu’elle dépasse un gigaohm. Une fois qu’un joint gigaohm se forme, relâchez la pression négative. L’amphotéricine commence à agir. La résistance d’entrée diminue lentement et le courant circulant en réponse au pas de tension de 5 millivolts augmente progressivement à mesure que l’amphotéricine pénètre dans la membrane.