Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 4:11 min • July 8th, 2025
Prenez des ganglions de la racine dorsale de rat immobilisés, ou DRG, dans une chambre d’enregistrement imprégnée d’un LCR.
DRG contient des neurones sensoriels entourés de cellules gliales satellites.
Appliquez une pression positive sur une pipette patch remplie de solution intracellulaire et connectée à un amplificateur, puis faites-la avancer vers le neurone cible.
La pression positive aide à traverser la couche de cellules gliales satellites environnante et à entrer en contact avec le neurone, formant une indentation sur sa membrane.
Appliquez une pression négative pour former un joint étanche avec la membrane.
Ensuite, appliquez des impulsions de pression négative pour établir la configuration de la cellule entière. Calibrez les paramètres de l’amplificateur pour des mesures de signal précises.
Pour déterminer l’excitabilité du neurone, appliquez de brefs courants incrémentiels dans le neurone, ouvrant les canaux ioniques voltage-dépendants et déclenchant un potentiel d’action.
Mesurez la rheobase, le courant minimum nécessaire pour déclencher un potentiel d’action.
De plus, appliquez un courant de rampe pour mesurer le potentiel de membrane minimum auquel le potentiel d’action se produit.
Dans cette procédure, placez la solution d’électrode sur de la glace pour éviter la dégradation. Ensuite, remplissez la pipette patch en verre avec une solution intracellulaire filtrée. Ensuite, placez la pipette dans le porte-pipette de la tête.
Appliquez une légère pression positive sur la pipette à l’aide d’une seringue de 5 millilitres en déplaçant le piston d’environ 1 millilitre avant d’abaisser la pipette dans la solution du bain. Ensuite, choisissez le mode V-clamp sur l’amplificateur et ouvrez l’interface de test de membrane dans le logiciel.
Sous le microscope, rapprochez la pipette du neurone cible. Ensuite, appliquez une pression positive à partir de la pipette pour traverser la couche de cellules gliales satellites jusqu’à ce qu’un élargissement soudain de l’espace entre le neurone et la couche environnante de cellules gliales satellites soit observé. Ensuite, continuez à déplacer la pipette vers le neurone jusqu’à ce qu’une fossette soit observée sur le neurone.
Dans notre préparation, les neurones sont entourés de cellules gliales satellites. Par conséquent, pour pénétrer dans les couches de cellules gliales et atteindre les neurones individuels, la pipette d’enregistrement est maintenue à une pression positive élevée.
Après cela, réduisez la pression positive. Obtenez une étanchéité gigaohm avec une aspiration douce.
Pour obtenir une configuration d’enregistrement de cellules entières, pénétrez la membrane cellulaire du neurone par une aspiration courte mais forte.
Vous pouvez également utiliser la fonction zap de l’amplificateur pendant que l’aspiration est appliquée.
Une fois qu’un mode de cellule entière est établi, compensez la capacité de la cellule entière et la résistance série en tournant les boutons de compensation de capacité et de résistance de l’amplificateur. Ensuite, fermez la fenêtre de test de membrane. Choisissez le mode normal I-clamp en tournant le bouton de mode de l’amplificateur.
Ensuite, cliquez sur Ouvrir le protocole dans le logiciel. Sélectionnez et chargez le protocole de mesure de la rhéobase, puis cliquez sur Enregistrer pour démarrer l’enregistrement. Pour examiner l’excitabilité neuronale, mesurez la résistance d’entrée et la rhéobase en injectant une série graduée de courants dépolarisants par pas de 100 picoampères.