Isolement de protéines de surface cellulaire et intracellulaires à partir d’une culture d’astrocytes

Prenez une culture d’astrocytes et retirez le milieu. Ajoutez un tampon physiologique et incubez sur de la glace, inhibant l’endocytose des protéines de surface cellulaire.

Incuber avec un réactif de biotinylation qui lie les protéines de surface cellulaire.

Ensuite, incubez avec un tampon d’extinction pour inactiver tout réactif n’ayant pas réagi.

Ajoutez un tampon physiologique froid et détachez mécaniquement les cellules. Transférez les cellules, puis centrifugez et jetez le surnageant.

Incuber avec un tampon de lyse pour lyser les cellules, libérant ainsi des protéines intracellulaires biotinylées à la surface des cellules et non biotinylées.

Centrifugez, collectez le surnageant et séparez une fraction avec la teneur totale en protéines.

Incuber la fraction restante sous agitation avec des billes enrobées de streptavidine qui lient les protéines biotinylées.

Faites tourner les billes liées aux protéines de surface cellulaire et séparez le surnageant contenant des protéines intracellulaires.

Lavez les billes sous agitation pour éliminer les protéines non spécifiquement liées, puis centrifugez et jetez le surnageant, isolant ainsi les protéines de surface cellulaire.

Les fractions contenant des protéines totales, intracellulaires et de surface cellulaire sont prêtes à être analysées.

Pour commencer cette procédure, retirez les cultures d’astrocytes de l’incubateur et jetez le milieu par aspiration. Lavez les cellules trois fois avec 4 millilitres de CM-PBS réfrigéré et placez la vaisselle sur de la glace pilée.

Retirez le CM-PBS par aspiration, puis pipetez deux millilitres de tampon de biotine dans chaque puits. Inclinez doucement les plats d’avant en arrière à quelques reprises, pour assurer une couverture complète avant de placer les cultures sur de la glace pendant 30 minutes.

Ensuite, retirez le tampon de biotine, remplacez-le par quatre millilitres de tampon de trempe et conservez les cultures sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez et remplacez par la même quantité de tampon de trempe avant de laisser les cultures sur de la glace pendant 10 minutes.

Ensuite, jetez le tampon de trempe et lavez les cellules trois fois avec 4 millilitres de CM-PBS réfrigéré. Ensuite, grattez les cellules en un millilitre de CM-PBS réfrigéré et transférez la suspension dans un tube de microcentrifugation.

Ensuite, granulez les cellules par centrifugation à 100 g pendant trois minutes dans une microcentrifugeuse réfrigérée réglée à 4 degrés Celsius. Après cela, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon de lyse.

Ensuite, laissez les échantillons sur de la glace pendant 30 minutes, en tourbillonnant toutes les cinq minutes. Ensuite, centrifugez le lysat à 14 000 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius pour granuler tout détergent et matière soluble. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation. Économisez 50 microlitres de lysat et ajoutez-y 25 microlitres de tampon de chargement 3x.

Par la suite, dénaturez-le en le chauffant à 95 degrés Celsius dans un bain sec. Il s’agit de la fraction d’entrée contenant à la fois des protéines de surface cellulaire biotinylées, ainsi que des protéines cytosoliques non biotinylées. À l’aide d’une pointe de pipette coupée, transférez 75 microlitres de billes d’agarose streptavidine dans le lysat et incubez-le à 4 degrés Celsius pendant trois heures sur un agitateur.

Après cela, granulez les billes d’agarose streptavidine par centrifugation à 1 500 g pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius. Économisez 50 microlitres de surnageant et ajoutez 25 microlitres de tampon de chargement 3x. Ensuite, dénaturez-le à 95 degrés Celsius dans un bain-marie ou un bloc chauffant. Celle-ci représente la fraction intracellulaire et est composée principalement de protéines cytosoliques non biotinylées.

Ensuite, remettez les billes en suspension dans un millilitre de tampon de lavage et secouez-les pendant trois minutes à 4 degrés Celsius. Granulez les perles et jetez le surnageant. Répétez ce processus quatre fois de plus pour minimiser la liaison non spécifique des protéines cytosoliques non biotinylées.

Ajouter 50 microlitres de tampon de chargement dilué à 1x à l’aide d’un tampon de lyse. Libérez la biotine et la streptavidine des billes en les dénaturant à 95 degrés Celsius. Cette fraction ne doit contenir que des protéines biotinylées à la surface des cellules.