Isolement de protéines de surface cellulaire et intracellulaires à partir d’une culture d’astrocytes

Prenez une culture d’astrocytes et retirez le milieu. Ajoutez un tampon physiologique et incubez sur de la glace, inhibant l’endocytose des protéines de surface cellulaire.

Incuber avec un réactif de biotinylation qui lie les protéines de surface cellulaire.

Ensuite, incubez avec un tampon d’extinction pour inactiver tout réactif n’ayant pas réagi.

Ajoutez un tampon physiologique froid et détachez mécaniquement les cellules. Transférez les cellules, puis centrifugez et jetez le surnageant.

Incuber avec un tampon de lyse pour lyser les cellules, libérant ainsi des protéines intracellulaires biotinylées à la surface des cellules et non biotinylées.

Centrifugez, collectez le surnageant et séparez une fraction avec la teneur totale en protéines.

Incuber la fraction restante sous agitation avec des billes enrobées de streptavidine qui lient les protéines biotinylées.

Faites tourner les billes liées aux protéines de surface cellulaire et séparez le surnageant contenant des protéines intracellulaires.

Lavez les billes sous agitation pour éliminer les protéines non spécifiquement liées, puis centrifugez et jetez le surnageant, isolant ainsi les protéines de surface cellulaire.

Les fraction