JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 2:55 min • July 8th, 2025
Commencez avec un tube contenant des billes magnétiques prétraitées enrobées d’anticorps spécifiques à une protéine cible réticulé à l’ADN.
Ajoutez un lysat de motoneurone contenant des fragments d’ADN et incubez avec agitation.
Les fragments d’ADN interagissent avec les billes enrobées d’anticorps, formant des complexes perles-ADN.
Centrifugeuse pour recueillir le liquide du capuchon et le placer sur un séparateur magnétique pour précipiter les complexes billes et ADN.
Retirez le surnageant contenant des fragments d’ADN non liés.
Introduire un tampon de lyse à base de détergent pour solubiliser les fragments d’ADN non spécifiquement liés.
Centrifuger et effectuer la séparation magnétique, puis retirer le surnageant.
Laver avec un tampon à haute teneur en sel pour perturber les interactions non spécifiques. Centrifugez, effectuez la séparation magnétique et retirez le surnageant.
Laver avec un tampon LiCl pour éliminer les interactions non spécifiques restantes. Centrifugez, effectuez la séparation magnétique et retirez le surnageant.
Enfin, lavez avec un tampon Tris-HCl, centrifugez et effectuez la séparation magnétique.
Retirez le surnageant et collectez les billes contenant les complexes protéine-ADN cibles.
Pour commencer l’immunoprécipitation de la chromatine, lavez les billes enrobées d’anticorps dans 1 millilitre de solution bloquante. Placez le tube contenant les billes enrobées d’anticorps sur une plate-forme à bascule à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Après avoir brièvement essoré, placez le tube sur une grille magnétique et retirez le surnageant.
Remettez en suspension les billes enrobées d’anticorps dans 50 microlitres de solution de blocage. Ajoutez 1 millilitre de lysats soniqués aux billes enrobées d’anticorps. Ensuite, incubez l’échantillon sur une plate-forme à bascule à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Après avoir laissé l’échantillon incuber pendant la nuit, prélevez le liquide du capuchon en faisant tourner brièvement le tube. Ensuite, placez le tube sur un support magnétique, et après 1 minute, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.
Ensuite, effectuez une série de lavages comme suit. Ajoutez 1 millilitre de tampon de lavage à froid contenant de l’IPC à l’échantillon. Mélangez l’échantillon sur une plate-forme à bascule à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Faites tourner brièvement le tube d’échantillon. Ensuite, placez-le sur une grille magnétique. Au bout de 1 minute, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.