Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 4:38 min • July 8th, 2025
Commencez par une plaque de culture traitée avec un agent anti-mitotique qui inhibe la croissance des cellules gliales, laissant principalement les neurones granulaires cérébelleux et un petit nombre de cellules gliales.
Retirez le milieu et ajoutez lentement une solution saline froide tamponnée au phosphate ou du PBS pour maintenir la viabilité cellulaire.
Remplacez le tampon par un mélange de coloration à froid et incuber.
Ce mélange contient du diacétate de fluorescéine ou FDA, un composé non fluorescent, et de l’iodure de propidium ou PI, un colorant fluorescent imperméable à la membrane.
La FDA se diffuse dans les cellules, où l’estérase fonctionnelle des cellules vivantes la convertit en un composé fluorescent vert.
L’IP pénètre dans les cellules mortes à travers les membranes endommagées, se lie à l’ADN et émet une fluorescence rouge.
Retirez la solution colorante et ajoutez du PBS froid pour éviter que les cellules ne sèchent.
Obtenez des images fluorescentes pour les colorants FDA et PI et une image en contraste de phase. Fusionnez les images FDA et PI.
Comparez ensuite cette image de fluorescence avec l’image en contraste de phase, qui permet d’exclure les grandes cellules gliales.
La fluorescence rouge indique la mort neuronale, tandis que la fluorescence verte signifie la viabilité neuronale.
Commencez la coloration en mélangeant le diacétate de fluorescéine à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et l’iodure de propidium à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre dans 10 millilitres de PBS. Mélangez la solution d’IP de la FDA par vortex et placez-la sur de la glace. Placez la plaque de culture sur de la glace.
Aspirez soigneusement le milieu de culture sans toucher les cellules avec la pointe de la pipette. Ensuite, ajoutez lentement le PBS froid. Aspirez le PBS, puis ajoutez la solution de travail FDA PI ou FDA PI Hoechst. Mettez l’assiette sur de la glace pendant cinq minutes. Ensuite, après avoir aspiré la solution de travail FDA PI ou FDA PI Hoechst, ajoutez du PBS froid dans chaque puits.
Assurez-vous que le microscope fluorescent est correctement installé. Détectez les émissions de fluorescence pour FDA PI et Hoechst à 520, 620 et 460 nanomètres, respectivement, en utilisant un temps d’exposition compris entre 100 et 300 millisecondes et un gain analogique de 2,8X. Après avoir collecté des images de fluorescence, prenez une image sous une lumière normale à l’aide du mode Contraste de phase.
Pour la double coloration de l’IP de la FDA, superposez les images des cellules en faisant glisser la couche positive de la FDA sur la couche positive de l’IP dans le logiciel d’édition graphique. Ajustez l’opacité du calque positif FDA en entrant 50 % dans le champ d’opacité du panneau Calques. Fusionnez deux calques en ouvrant le menu Calque et en cliquant sur le bouton Fusionner visible. Réglez le contraste des images superposées en entrant 50 dans le champ de contraste sous Image, Réglages, Luminosité/Contraste. Vérifiez qu’il n’y a pas de cellules double-positives FDA et PI dans les images de superposition.
Pour la triple coloration FDA PI Hoechst, superposez les images des cellules en faisant glisser à nouveau la couche FDA-positive sur la couche PI-positive, en ajustant l’opacité de la couche FDA-positive et en fusionnant les images comme précédemment. Ensuite, faites glisser le calque positif Hoechst sur le calque fusionné.
Ajustez l’opacité du calque Hoechst-positif en entrant 50 % dans le champ d’opacité du panneau Calques, et fusionnez les deux calques en ouvrant le menu Calque et en cliquant sur le bouton Fusionner visible. Distinguez visuellement les grandes cellules gliales irrégulières des neurones granulaires cérébelleux en comparant les images prises en mode fluorescent avec celles prises en mode contraste de phase.