Évaluation de la viabilité neuronale dans une culture de neurones cérébelleux par double coloration

Commencez par une plaque de culture traitée avec un agent anti-mitotique qui inhibe la croissance des cellules gliales, laissant principalement les neurones granulaires cérébelleux et un petit nombre de cellules gliales.

Retirez le milieu et ajoutez lentement une solution saline froide tamponnée au phosphate ou du PBS pour maintenir la viabilité cellulaire.

Remplacez le tampon par un mélange de coloration à froid et incuber.

Ce mélange contient du diacétate de fluorescéine ou FDA, un composé non fluorescent, et de l’iodure de propidium ou PI, un colorant fluorescent imperméable à la membrane.

La FDA se diffuse dans les cellules, où l’estérase fonctionnelle des cellules vivantes la convertit en un composé fluorescent vert.

L’IP pénètre dans les cellules mortes à travers les membranes endommagées, se lie à l’ADN et émet une fluorescence rouge.

Retirez la solution colorante et ajoutez du PBS froid pour éviter que les cellules ne sèchent.

Obtenez des images fluorescentes pour les colorants FDA et PI et une image en contraste de phase. Fusionnez les images FDA et PI.

Comparez ensuite cette image de fluorescence avec l’image en contraste de phase, qui permet d’exclure les grandes cellule