Visualisation des neurones du corps des champignons dans le cerveau des drosophiles via l’immunomarquage

Placez les cerveaux de drosophile de type sauvage et mutants dans une solution contenant un fixateur et un détergent. Incuber avec un léger balancement.

Le fixateur préserve la morphologie des tissus, tandis que le détergent perméabilise les membranes cellulaires.

Laissez le cerveau se déposer, puis retirez la solution.

Lavez les mouchoirs avec un tampon.

Ajoutez une solution bloquante pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Retirez la solution et ajoutez-y des anticorps primaires ciblant une protéine spécifique qui régule le développement axonal dans les neurones du corps champignon du cerveau.

Incuber pour favoriser la liaison des anticorps.

Laver avec un tampon pour éliminer les anticorps non liés.

Incuber avec des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores ciblant les anticorps primaires.

Lavez à nouveau pour éliminer les anticorps non liés, puis remettez les cerveaux en suspension dans un milieu de montage.

Montez les cerveaux sur une lame de pont et visualisez-les au microscope à fluorescence.

Par rapport au type sauvage, les cerveaux mutants présentent un phénotype défectueux, avec des erreurs de projections axonales et des lobes MB manquants.

Au microscope, à l’aide d’une pipette P200, transférez 10 à 15 cerveaux disséqués du même génotype dans un tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre rempli de paraformaldéhyde à 4 % dilué dans du PTN. Ensuite, incubez les cerveaux pendant 20 minutes avec un balancement lent à température ambiante. Après la fixation, laissez le cerveau se déposer au fond du tube, puis retirez le fixateur.

Ensuite, effectuez deux lavages rapides avec 500 microlitres de PTN par lavage. Remplacez le PTN dès que le cerveau s’installe dans le tube. Ensuite, effectuez trois longs lavages avec PTN en utilisant une agitation douce à température ambiante.

Après ces lavages, les cerveaux peuvent être stockés pendant la nuit à 4 degrés Celsius dans PTN. Après avoir retiré le dernier lavage PTN, incubez les cerveaux dans 0,5 millilitre de solution bloquante pendant au moins 30 minutes à température ambiante et en agitant doucement. Après avoir retiré la solution de blocage, ajoutez les anticorps primaires dilués dans la solution de blocage et incubez les cerveaux à 4 degrés Celsius pendant deux jours avec une agitation douce.

Retirez l’anticorps primaire à l’aide du régime de lavage PTN à 5 lavages, puis appliquez les anticorps secondaires. Laissez ces anticorps incuber avec les tissus pendant trois heures à température ambiante tout en étant à l’abri de la lumière par balancement.

Après avoir incubé les cerveaux dans la solution d’anticorps secondaire, appliquez le régime de lavage PTN, en recouvrant les échantillons de papier d’aluminium après chaque lavage, et terminez en retirant autant de tampon que possible. Ensuite, ajoutez 75 microlitres de support de montage fluorescent anti-décoloration et faites entrer et sortir le cerveau et le support de la pointe de la pipette une seule fois. Le tube peut ensuite être enveloppé dans du papier d’aluminium et stocké à 4 degrés Celsius pendant plusieurs jours, mais idéalement, procédez directement au montage.

Pour monter les cerveaux, construisez un toboggan de pont. Placez deux lamelles de base à environ 1 centimètre l’une de l’autre sur une glissière chargée positivement. Assurez-vous que la diapositive chargée positivement est face vers le haut. Ensuite, collez les lamelles sur la lame avec du vernis à ongles pour doigts et laissez le vernis sécher complètement avant de continuer.

Ensuite, placez la lame sous un stéréomicroscope et pipetez les cerveaux et le milieu dans l’espace entre les lamelles. Assurez-vous d’ajuster l’éclairage pour améliorer la visualisation du cerveau.

Ensuite, aspirez le support de montage supplémentaire de la diapositive en prenant soin d’éviter les cerveaux. Ensuite, évacuez l’excédent de support de montage. Cela permettra de positionner plus précisément les cerveaux.

Maintenant, à l’aide de pinces, orientez les cerveaux en une grille avec leurs lobes antennaires vers le haut. Ensuite, placez une lamelle sur la cervelle et utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords de la lamelle supérieure qui sont fixés aux lamelles de base. Maintenant, chargez la cavité centrale avec un nouveau support de montage dans le sens de la goutte, permettant au support d’être tiré sous la lamelle par capillarité. Lorsque la cavité est remplie, scellez-la complètement à l’aide de vernis à ongles transparent.