Étude d’une lésion cérébrale d’une larve de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie électronique à transmission à balayage à grande échelle

Prenez des sections de cerveau ultraminces enrobées de résine et fixées chimiquement de larves de poisson-zèbre saines et cérébralement blessées montées sur une grille à un trou.

Les sections sont colorées avec des métaux lourds pour améliorer le contraste de l’image lors de l’imagerie microscopique.

Placez la grille dans un porte-échantillon et transférez-la dans la chambre de microscopie.

Alignez la grille sous le canon à électrons, qui génère un faisceau d’électrons.

Un réseau de lentilles et de bobines électromagnétiques concentre le faisceau d’électrons sur les sections.

Déplacez le porte-échantillon pour numériser les sections selon un motif raster.

Lorsque le faisceau d’électrons passe à travers les sections de tissu, les régions denses en électrons colorés dispersent plus d’électrons, tandis que les régions non colorées transmettent les électrons.

Le détecteur collecte ces signaux électroniques, créant ainsi des images cérébrales à haute résolution.

Par rapport au contrôle, le cerveau lésé présente une microglie phagocytaire contenant de nombreuses inclusions intracellulaires, une caractéristique de la neurodégénérescence induite par une lésion.

Pour monter l’échantillon dans le microscope électronique à balayage ou le MEB, placez la grille de la boîte de transfert avec la section dans le porte-échantillon à grilles multiples et transférez-la dans la chambre du MEB. Après avoir aligné le détecteur selon le protocole de texte, pré-irradiez l’échantillon en effectuant un zoom arrière afin que la zone complète à scanner s’adapte à la fenêtre de l’image. Une fois que l’ouverture a été modifiée à 120 micromètres et que l’image a été défocalisée, utilisez l’option de balayage de zone réduite pour rendre la zone numérisée aussi étroite que possible.

Ensuite, réglez la fréquence d’images pour numériser une image en 1 à 2 secondes environ. Ensuite, zoomez au moins 100x et scannez une petite zone pendant dix secondes. Si la luminosité de la zone change toujours, continuez la pré-irradiation. Lorsque cette zone ne change pas de luminosité par rapport à son environnement, la pré-irradiation est suffisante.

Lorsque vous effectuez la mise au point, sélectionnez la zone ou l’élément le plus clair et réglez la vitesse de balayage de manière à ce que les détails soient visibles. Dans le logiciel du microscope, ajustez la luminosité et le contraste en regardant attentivement l’histogramme pour garder tous les pixels dans la plage dynamique. Faites de même pour les zones et les fonctionnalités les plus sombres. Revenez à la zone claire et vérifiez à nouveau qu’il y a de l’espace des deux côtés de l’histogramme.

Pour les étapes 4-6 à 4-8, le réglage de la luminosité et du contraste doit être effectué très soigneusement afin que toute la zone soit dans la plage dynamique.

Faites un zoom arrière pour que la zone complète à numériser s’adapte à la fenêtre d’imagerie et lancez le programme d’acquisition de grandes zones. Ensuite, utilisez l’option Assistant pour configurer une mosaïque en sélectionnant une zone à l’écran.

Utilisez une taille de pixel de 2 à 5 nanomètres en fonction des détails nécessaires et réglez un temps d’arrêt de trois microsecondes pour la microscopie électronique à transmission à balayage ou STEM. Appuyez sur Optimiser pour vérifier les paramètres du microscope et le temps nécessaire s’affichera. Ensuite, allumez à nouveau le générateur de balayage externe et appuyez sur Continuer.