Génération d’organoïdes neuronaux dopaminergiques à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Prenez des cellules souches embryonnaires humaines, ou CSEh, dans un flacon recouvert d’une matrice extracellulaire.

Remplacez le milieu par un milieu d’induction neurale et incubez, en différenciant les CSEh en colonies de cellules progénitrices neurales, ou NPC.

Ajouter une solution enzymatique pour dissocier les colonies.

Centrifugez, éliminez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu d’induction avec des facteurs de croissance pour soutenir la différenciation des NPC.

Ajoutez la suspension cellulaire sur des micropuits de forme pyramidale inversée pour former des neurosphères tridimensionnelles.

Transférez les neurosphères dans une plaque recouverte d’une matrice extracellulaire contenant un milieu de différenciation avec des facteurs de croissance et de petites molécules. Incuber sous agitation pour favoriser la différenciation en neurones progéniteurs dopaminergiques.

Remplacer le milieu par un milieu de maturation neurale et placer les neurosphères sur un disque membranaire dans un insert de puits de culture, permettant la diffusion de l’air et des nutriments.

Incuber dans des conditions statiques pour former des organoïdes tridimensionnels constitués de neurones dopaminergiques matures.

Ces organoïdes, imitant un cerveau en développement, sont utiles pour étudier la dégénérescence des neurones dopaminergiques, une caractéristique de la maladie de Parkinson.

Remplacez le milieu de cellules souches utilisé pour maintenir les caractéristiques de pluripotence des CSEh, par un milieu sans sérum contenant un cocktail d’inhibition double de SMAD pour démarrer l’induction neurale, et 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK pour augmenter le taux de survie des cellules lors du passage le lendemain. Le premier jour, préparez la plaque de micropuits avec 2,5 millilitres par puits de milieu sans sérum contenant la même concentration d’inhibiteur de ROCK et de molécules d’inhibition double SMAD.

Pour différencier les cellules vers le modèle ventral du tube neural, ajoutez SHH et FGF8 à 100 nanogrammes par millilitre et deux agonistes lissés micromolaires. Après avoir ajouté le fluide, centrifugez la plaque à 1 200 fois g pendant cinq minutes pour éliminer les bulles d’air des micropuits. Une fois que la plaque de micropuits est prête à l’emploi avec un milieu à moitié différenciateur, retirez le milieu des CSEh et lavez-le rapidement avec du PBS sans chlorure de calcium et de magnésium.

Dissocier les colonies en une suspension unicellulaire en ajoutant 7,5 mL de solution enzymatique recombinante dans une fiole T75. Incuber les cellules pendant deux minutes à 37 degrés Celsius, puis ajouter 7,5 de DMEM F-12. Ensuite, prélevez la suspension cellulaire et centrifugez à 300 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant et comptez les cellules dans le même milieu que celui utilisé pour préparer la plaque de micropuits.

Ajustez le volume du milieu pour obtenir une suspension cellulaire, permettant de former des neurosphères contenant 1 000 cellules par micropuits, en préparant 4,7 millions de cellules dans 2,5 millilitres de milieu, et en l’ajoutant aux 2,5 millilitres de milieu déjà placés dans la plaque. Afin de répartir correctement les cellules dans chaque micropuits, secouez doucement la plaque et centrifugez-la à 300 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 heures pour générer des sphères.

Le deuxième jour, rincez doucement les micropuits avec du milieu et transférez les sphères dans une plaque à six puits traitée en tissu. Placez les sphères en rotation à 37 degrés Celsius et changez la moitié du milieu avec du milieu frais tous les deux à trois jours. Du 3e au 13e jour, pour améliorer l’induction neuronale et convertir en progéniteurs neuronaux avec une identité mésencéphalique, complétez le milieu avec trois inhibiteurs micromolaires de GSK-3-bêta. Divisez l’échantillon en deux nouvelles plaques à six puits traitées pour réduire la densité des sphères et éviter l’agrégation des sphères.

Le huitième jour, commencez la maturation neuronale en passant à un nouveau milieu avec des facteurs de croissance, et changez de milieu tous les deux à trois jours. Le 21e jour, placez une plaque de culture dans un puits d’une nouvelle plaque à six puits et ajoutez 1,2 millilitre de milieu de maturation neurale utilisé pour la différenciation de la neurosphère sous l’insert membranaire. Ensuite, déposez la membrane PTFE sur un insert de plaque de culture.

Enfin, pour générer l’organoïde neural, ensemencez environ 100 neurosphères dans des conditions d’interface air-liquide sur la membrane PTFE. Arrêtez la rotation à partir de cette étape et changez de milieu tous les deux à trois jours jusqu’à ce que le point de différenciation requis soit atteint.