Coloration immunofluorescente de sialoglycoprotéines dans des cellules et des neurones progéniteurs neuraux

Prenez les cellules souches et progénitrices neurales primaires et les neurones, qui ont des sialoglycoprotéines marquées par un rapporteur d’acide sialique.

Ajouter du paraformaldéhyde pour fixer les cellules. Éliminer l’excès de paraformaldéhyde à l’aide d’un tampon.

Incuber avec un mélange réactionnel contenant des sondes chimiques à base de biotine, un agent réducteur et un catalyseur à base de métal.

L’agent réducteur active le catalyseur, facilitant la biotinylation des sialoglycoprotéines.

Retirez le mélange réactionnel et lavez-le avec un tampon. Ajoutez de la streptavidine conjuguée aux fluorophores pour lier les sialoglycoprotéines biotinylées.

Retirez la streptavidine non liée et lavez-la avec un tampon. Ajoutez des protéines et un détergent non ionique pour bloquer les sites non spécifiques et perméabiliser les cellules.

Retirez cette solution et incubez avec des anticorps primaires ciblant des protéines cellulaires spécifiques.

Retirez les anticorps non liés.

Incuber avec des anticorps secondaires marqués au fluorophore et un colorant fluorescent pour lier les anticorps primaires liés aux protéines et marquer les noyaux.

Retirez les molécules non liées. Laver avec un tampon.

À l’aide de la microscopie à fluorescence, imagez les cellules pour visualiser les sialoglycoprotéines fluorescentes et les protéines cellulaires.

Tout d’abord, retirez les inserts des plaques de coculture et aspirez le milieu de culture par le fond des puits. Ensuite, lavez les cellules neurales une fois avec du PBS préchauffé. Aspirez le PBS des puits et ajoutez 1 millilitre de paraformaldéhyde pré-refroidi à 4 % dans du PBS dans chaque puits.

Fixez les cellules à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du PBS pré-réfrigéré. Aspirez le PBS et ajoutez 1 millilitre de tampon conjugué à la biotine I fraîchement préparé dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Après cela, aspirez le tampon de réaction des puits et lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ajoutez 1 millilitre de tampon de coloration dans chaque puits de cellules et incubez à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, aspirez le tampon de coloration des puits et lavez les cellules trois fois avec du PBS pré-refroidi. Ajoutez 1 millilitre de tampon de blocage à chaque puits de cellules et incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Retirez le tampon de blocage des puits et ajoutez 1 millilitre de solution d’anticorps primaires dans chaque puits. Incuber les cellules pendant la nuit à 4 degrés Celsius.

Le lendemain, retirez la solution d’anticorps primaires des puits. Lavez les cellules trois fois avec du PBS pré-réfrigéré. Aspirez le PBS des puits et ajoutez 1 millilitre d’anticorps secondaires dans chaque puits. Incuber les cellules à température ambiante pendant deux heures. Après cela, aspirez la solution des puits et lavez les cellules trois fois avec du PBS pré-refroidi.