Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
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Commencez par une lame de culture multi-puits contenant des neurones d’un embryon de souris dans un milieu.
Les neurones présentent des cônes de croissance à l’extrémité de leurs axones en croissance. Ces structures comprennent de minces projections appelées filopodes et des extensions en forme de feuille appelées lamellopodes, qui sont constituées de filaments d’actine et de microtubules, composants du cytosquelette.
Traitez les puits d’essai avec de la protéine agrégée de β-amyloïde, ou Aβ, et les puits de contrôle avec une solution de véhicule.
Dans les puits d’essai, l’agrégat Aβ se lie aux récepteurs membranaires, initiant une signalisation en aval qui phosphoryle les protéines régulatrices du cytosquelette.
Les protéines phosphorylées perturbent les filaments d’actine et les microtubules, déstabilisant l’intégrité structurelle du cône de croissance et provoquant son effondrement.
Incuber avec un fixateur pour préserver la structure cellulaire, puis laver les cellules et les monter pour l’imagerie.
À l’aide d’un microscope, comparez les structures cellulaires dans les puits d’essai et de contrôle.
Une augmentation de l’occurrence de l’effondrement des cônes de croissance dans les neurones traités par Aβ indique l’effet toxique des agrégats Aβ.
Commencez ce test au moins une semaine à l’avance en ouvrant un flacon frais d’A-bêta-42 complet obtenu dans le commerce et en dissolvant le contenu dans de l’eau distillée stérile à une concentration de 0,5 millimolaire. Incuber à 37 degrés Celsius pendant sept jours pour induire l’agrégation et la toxicité. Préparez des aliquotes de A-bêta-42 agrégé et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à utilisation.
Le quatrième jour de la culture neuronale, traitez les puits avec 100 microlitres de A-bêta-42 agrégé de 0,5 micromolaire ou de solution de véhicule dans le milieu B pendant une heure, comme démontré précédemment. Une fois l’heure écoulée, retirez le milieu de culture et fixez immédiatement les neurones avec du paraformaldéhyde à 4 % contenant 4 % de saccharose dans du PBS pendant une heure à 37 degrés Celsius sur une plaque chauffante.
La fixation est surtout importante car le maintien de la forme des cônes de croissance est essentiel pour ce protocole.
Après la fixation, lavez les neurones trois fois avec du PBS. Ensuite, après avoir retiré la chambre, montez les neurones avec un milieu de montage aqueux. Faites sécher le support de montage à 4 degrés Celsius pendant deux à quatre jours. Capturez toute la zone de chaque puits avec un objectif sec 20x sur un microscope inversé.
Il est important de capturer et d’analyser toute la zone de chaque puits pour éviter la subjectivité.
Classez les neurites les plus longs de chaque neurone au stade 3 ou 4 comme axones. Les cônes de croissance axonale dépourvus de lamellipodes ou possédant moins de trois filopodes sont considérés comme des cônes de croissance affaissés.