Visualisation de peptides bêta-amyloïdes dans des tranches de cerveau cortical humain

Prenez une lame de verre contenant une tranche corticale de tissu cérébral prélevée sur un patient atteint de la maladie d’Alzheimer. Le tissu contient des dépôts bêta-amyloïdes insolubles dans le parenchyme et les capillaires cérébraux.

Immergez la lame dans de l’alcool dilué pour éliminer les lipides et les sels.

Laver avec de l’alcool absolu pour déshydrater les tissus, puis appliquer un fixateur pour préserver l’architecture des tissus.

Séchez la lame sous vide, en éliminant toute humidité.

Traiter avec de la vapeur d’acide formique dans un environnement humidifié pour décomposer les agrégats de bêta-amyloïde en peptides solubles plus petits.

À l’aide d’un scanner optique, générez des images des caractéristiques structurelles du tissu pour interpréter les données de la spectrométrie de masse d’imagerie.

Vaporisez une solution matricielle sur l’échantillon.

À l’aide d’un spectromètre de masse, appliquez un laser que la matrice absorbe pour ioniser les peptides. Un détecteur les identifie ensuite en fonction de leur rapport masse/charge.

Analyser les données pour produire des images, révélant la distribution des peptides bêta-amyloïdes dans le parenchyme tissulaire et les capillaires cérébraux.

Pour rincer les sections de tissus, plongez les échantillons dans 40 à 100 millilitres d’éthanol à 70 % dans un bocal en verre pendant 30 secondes pour éliminer les lipides endogènes et les sels inorganiques. Lavez les échantillons en utilisant la séquence de lavage indiquée dans le protocole textuel. Ensuite, séchez les échantillons sous vide pendant 30 minutes.

Maintenant, traitez les sections de tissu avec une vapeur d’acide formique pour une meilleure ionisation des protéines bêta-amyloïdes du tissu cérébral de l’autopsie. Pour ce faire, préparez le four à 60 degrés Celsius et un plat en verre d’incubation avec 5 millilitres d’acide formique à 100 %. Maintenez l’humidité de l’air dans la boîte en verre d’incubation à un niveau de saturation.

Placez les lames de tissu dans le bol en verre d’incubation tout en évitant l’immersion dans l’acide formique et traitez pendant six minutes. Prenez une image optique des échantillons à l’aide d’un scanner de film, d’un scanner de gel ou d’un microscope numérique. Effectuez cette étape à température ambiante.

L’alignement de l’image optique des échantillons est nécessaire lorsque la cible de l’échantillon est placée à l’intérieur de l’instrument. Habituellement, il ne sera pas possible de reconnaître la section de tissu sous la couche de matrice. Pour corréler les images optiques avec les échantillons, faites des repères visibles à la fois dans l’image optique et sous la couche matricielle dans l’optique de la caméra. Le moyen le plus simple est de repérer au moins trois marques de liquide de correction autour de l’échantillon avant de prendre l’image optique.

Pour pulvériser la matrice avec un pulvérisateur à ultrasons, retirez le tissu à pulvériser du dessiccateur et placez-le dans la chambre. Assurez-vous que le tissu ne recouvre pas la fenêtre du capteur. Démarrez la préparation en appuyant sur le bouton Démarrer. Habituellement, le temps de préparation est d’environ 90 minutes.

La préparation sera régulée automatiquement par le contrôle de l’épaisseur de la couche de matrice et de l’humidité. Alternativement, pour pulvériser la solution matricielle à la surface du tissu avec un pulvérisateur automatique, utilisez un système de pompe à solvant réglé à 10 PSI et 0,15 millilitre par minute pour administrer la solution matricielle.

Un flux constant de gaz de gaine chauffé sera délivré conjointement avec la pulvérisation de solution matricielle. Réalisez des expériences d’imagerie à haut débit et à haute résolution spatiale avec MALDI-IMS. Pour les mesures par spectrométrie de masse, définissez les zones tissulaires à l’aide du logiciel de contrôle MALDI et du logiciel d’analyse de données.

Acquérez des spectres en mode linéaire positif avec une plage de rapport masse/charge de 2 000 à 20 000 et une résolution spatiale de 20 et 100 microns. Pour fabriquer l’étalon, dissolvez l’étalon peptidique dans l’étalon de protéine dans un rapport de 1 à 4 avec CHCA dans une solution TA30, puis diluez-le 10 fois.

Placez 1 microlitre d’étalon d’étalonnage sur la lame à quatre endroits différents. À l’aide d’un logiciel d’histologie moléculaire, superposez plusieurs images de signaux pour trouver la corrélation spatiale de divers signaux, tels que différents peptides bêta-amyloïdes co-localisant dans les plaques séniles des parois artérielles.