Détection de microhémorragies cérébrales dans un modèle de rat

Les microhémorragies cérébrales, ou CMH, sont des hémorragies cérébrales neuroinflammatoires causées par la rupture de la barrière hémato-encéphalique, entraînant la fuite de globules rouges, ou GR, dans le tissu cérébral.

Pour détecter les CMH, commencez par utiliser du tissu cérébral fixe d’un rat atteint de CMH.

Immergez le tissu dans du saccharose pour la cryoprotection.

À l’aide d’un cryomicrotome, sectionnez le tissu et prélevez une section sur une lame de verre.

Laver pour éliminer les résidus de fixateur.

Appliquez un colorant à l’hématoxyline lié à un cation métallique qui interagit avec l’ADN chargé négativement, colorant le noyau en violet rougeâtre.

Poursuivez avec de l’alcool acide pour éliminer l’excès de colorant, puis appliquez un agent bleuissant alcalin pour neutraliser l’environnement acide et convertir le colorant en sa forme bleue, améliorant ainsi le contraste.

Lavez le mouchoir avec de l’alcool pour améliorer la pénétration de la tache, puis appliquez de l’éosine pour colorer les globules rouges en rouge-orange et les composants tissulaires en rose.

Déshydratez le tissu à l’aide de concentrations croissantes d’alcool et éclaircissez-le avec du xylène pour une visualisation microscopique.

Capturez des images pour détecter les fuites de globules rouges de couleur rouge-orange, confirmant les CMH.

Après avoir isolé le cerveau, immergez-le dans du saccharose à 20 % dans du PBS pendant au moins six heures ou jusqu’à ce que le cerveau coule au fond du tube. Changez la solution à 30 % de saccharose et fixez-la pendant encore six heures.

Enfin, préparez des coupes de tissu cérébral de 10 millimètres d’épaisseur à l’aide d’un cryostat. Commencez la coloration H&E en lavant les lames à l’eau distillée. Ensuite, plongez dans une solution d’hématoxyline pendant huit minutes. Après la coloration, laver à l’eau courante du robinet pendant cinq minutes. Différencier dans de l’alcool acide à 1 % pendant 30 secondes.

Après avoir lavé à l’eau courante du robinet pendant une minute, colorez dans de l’eau ammoniacale à 0,2 % ou une solution saturée de carbonate de lithium pendant 30 secondes à une minute. Ensuite, lavez-vous à l’eau courante du robinet pendant cinq minutes. Contre-colorez avec une solution d’éosine pendant 30 secondes à une minute. Déshydrater à 90 % d’alcool, puis à 95 % d’alcool et à l’alcool absolu pendant 0,5 à 2 minutes chacun.

Après déshydratation, éclaircir dans du xylène pendant 30 secondes. Après le montage, analysez la coloration H&E à l’aide d’un microscope à fluorescence à fond clair. Les globules rouges libérés par les vaisseaux sanguins, qui sont des composants des CMH, apparaissent en rouge-orange sous coloration H&E.