Préparation de neurones cultivés pour l’analyse optique de vésicules synaptiques recyclées

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurosciences

0 vues • 4:53 min • July 8th, 2025

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Commencez avec une lamelle contenant des neurones en culture exprimant des protéines de membrane de vésicule synaptique, y compris la synaptophysine et la synaptotagmine-1 marquées par fluorescence.

Retirez le milieu, ajoutez un mélange de tampon de dépolarisation et d’anticorps primaires, puis incuberez.

Les ions tampons pénètrent dans les cellules, stimulant la fusion des vésicules synaptiques avec la membrane, ce qui expose la synaptotagmine-1.

Les anticorps primaires se lient sélectivement à la synaptotagmine-1 exposée.

Jetez le tampon et lavez-le avec le milieu pour éliminer les anticorps non liés.

Introduire un milieu frais et incuber pour faciliter l’internalisation de la membrane, en formant des vésicules recyclées avec de la synaptophysine marquée et de la synaptotagmine-1 liée aux anticorps.

Retirez le fluide, fixez les cellules et lavez.

Introduire un tampon bloquant à base de détergent avec des anticorps secondaires couplés à des fluorophores.

Le détergent perméabilise les cellules, permettant aux anticorps secondaires d’interagir avec la synaptotagmine-1 liée aux anticorps.

Soulevez la lamelle, lavez-la à l’eau et séchez-la.

Placez la lamelle face vers le bas sur une lame avec un support d’enrobage pour l’analyse optique des vésicules recyclées à double étiquetage.

Préchauffez 600 microlitres de 1x tampon de dépolarisation et 10 millilitres de milieu de culture cellulaire à 37 degrés Celsius dans le bain-marie. Ajoutez 1 microlitre d’anticorps anti-SYT1 de souris au tampon de dépolarisation 1x et vortex pendant 10 secondes. Après avoir retiré et jeté le milieu de culture cellulaire des cellules, ajoutez 200 microlitres du mélange d’anticorps de dépolarisation dans chaque puits.

Incuber la plaque pendant 5 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 dans l’incubateur. Retirez et jetez le mélange d’anticorps de dépolarisation et lavez les cellules trois fois avec un milieu de culture cellulaire. Ajouter 1 millilitre de milieu de culture cellulaire dans chaque puits et incuber pendant 30 secondes à température ambiante.

Ensuite, retirez 750 microlitres de milieu et ajoutez la même quantité de milieu frais. Répétez ce processus trois fois. Ensuite, retirez et jetez le milieu de culture cellulaire et ajoutez 300 microlitres de PFA à 4 % dans 1x PBS.

Enfin, incubez pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius avant de laver trois fois pendant 5 minutes chacune avec 1x PBS. Diluer l’anticorps secondaire couplé à un fluorophore dans 200 microlitres de tampon de blocage pour chaque puits à une dilution de 1 à 1 000. Retirez et jetez le 1x PBS de chaque puits contenant les lamelles avec les neurones en culture.

Ajoutez 200 microlitres de mélange d’anticorps tampons bloquants dans chaque puits et incubez pendant 60 minutes à température ambiante. Après l’incubation, lavez les cellules trois fois pendant 5 minutes avec 1 millilitre de 1x PBS.

Ensuite, ajoutez une goutte de 7 microlitres de milieu d’enrobage sur la lame de microscope. Retirez la lamelle de la plaque à 24 puits en la soulevant à l’aide d’une canule et en la saisissant à l’aide d’une pince. Trempez la lamelle dans de l’eau distillée pour enlever le PBS et séchez-la soigneusement en touchant un bord à un tissu mou.

Retournez la lamelle sur la gouttelette du milieu d’enrobage de sorte que la surface portant les cellules fasse face à la lame de microscope, intégrant ainsi les cellules dans le milieu d’enrobage. Laissez sécher les lames sous le capot pendant une à deux heures, en les couvrant pour éviter l’exposition à la lumière. Conservez les lames séchées dans une boîte à lames de microscope à 4 degrés Celsius.

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Dernière mise à jour : 15 août 2026