Immunomarquage de neurones traités avec des agrégats d’alpha-synucléine

Commencez par une culture de neurones adhérents traitée avec de l’alpha-synucléine ou des agrégats alpha-S, qui sont des amas d’une protéine mal repliée.

Ces amas s’agrègent pour former des inclusions intracellulaires.

Remplacez le support par une solution de fixation pour préserver l’intégrité cellulaire.

Retirez la solution de fixation et lavez-la avec un tampon.

Ensuite, ajoutez un tensioactif pour perméabiliser la membrane cellulaire.

Retirez le tensioactif et lavez-le avec un tampon.

Introduire une solution de blocage pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Maintenant, incubez avec des anticorps primaires qui se lient spécifiquement aux inclusions alpha-S et aux protéines structurelles.

Laver avec un tampon pour éliminer les anticorps non liés.

Incuber avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence.

Retirez les anticorps non liés.

Ajoutez une coloration fluorescente pour marquer le noyau.

Enlevez la tache et lavez avec un tampon.

À l’aide d’un support de montage, montez la lamelle avec des neurones sur une diapositive.

Sous un microscope fluorescent, observez les inclusions alpha-S immunomarquées dans le neurone.

Pour effectuer l’immunofluorescence dans une hotte chimique, fixez les neurones avec 2 % de paraformaldéhyde dans une solution de PBS et 5 % de saccharose pendant 15 minutes à température ambiante sans agiter. Après 15 minutes, retirez la solution fixatrice et lavez brièvement les neurones avec du PBS trois fois.

Ensuite, perméabilisez les neurones avec 0,3 % de tensioactif non ionique dans du PBS pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez brièvement les neurones avec PBS trois fois. Incuber les neurones avec 3 % de FBS dans du PBS pendant 30 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital pour bloquer les sites de liaison non spécifiques. Ensuite, incubez les neurones avec l’anticorps primaire approprié dissous dans 3 % FBS dans PBS pendant la nuit dans la chambre froide ou au réfrigérateur pendant la nuit à 4 degrés Celsius sur un agitateur orbital.

Le lendemain, retirez la solution d’anticorps et lavez brièvement les cellules avec du PBS pendant trois fois. Ensuite, incubez les neurones avec l’anticorps secondaire fluorescent approprié dissous dans 3 % FBS dans PBS pendant 1 heure à température ambiante dans l’obscurité sur un agitateur orbital.

Retirez la solution d’anticorps et lavez-la brièvement avec du PBS pendant trois fois. Ensuite, colorez les neurones avec une solution de DAPI pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité sur un agitateur orbital. Après 15 minutes, retirez la solution d’anticorps et lavez-la brièvement avec du PBS pendant trois fois. Montez les lamelles sur la glissière à l’aide d’un support de montage anti-décoloration.