Un modèle in vitro de lésions d’étirement dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines induites

Commencez par une plaque sans fond à plusieurs puits fixée à une membrane en silicone. La membrane est recouverte d’un biopolymère pour faciliter l’adhésion cellulaire.

Introduire dans les puits des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines, ou hiPSCN, en suspension dans un milieu. Le milieu est complété par des protéines de matrice extracellulaire, ou ECM, pour améliorer l’adhésion cellulaire.

Incuber la plaque, permettant aux cellules d’adhérer aux protéines ECM et au biopolymère, favorisant une interaction uniforme avec la surface de la membrane.

Ensuite, fixez la plaque sur la scène d’un dispositif de blessure.

À l’aide de l’appareil, appliquez une indentation sur la membrane pour générer une contrainte mécanique contrôlée sur les neurones.

Le stress perturbe le cytosquelette, ce qui provoque la dégénérescence des protubérances cellulaires appelées neurites et la formation de petits gonflements le long des neurites.

Le stress endommage également l’intégrité de la membrane cellulaire, entraînant la mort cellulaire.

Les hiPSCN présentant un phénotype de lésion par étirement sont maintenant prêts pour l’analyse.

Pour étirer la plaque, remplacez les champs « Nom de fichier » et « Chemin d’accès au fichier » de l’instrument virtuel « Suivi de position » par un nom de fichier unique et cliquez sur la flèche Exécuter. Définissez la profondeur et la durée de l’indentation dans les champs « Blessure » et « Durée de la blessure » de l’instrument virtuel du panneau de contrôle du mouvement. Avec la plaque en position zéro, exécutez l’instrument virtuel « Movement Control Panel » et cliquez sur Injure pour indenter la plaque.

Cliquez sur le haut pour déplacer la platine vers le haut, en cliquant sur Arrêter lorsque la plaque est en position haute, et ouvrez la porte pour désactiver le dispositif de blessure. Ensuite, inspectez l’historique de déplacement de la platine présenté dans l’instrument virtuel « Position Tracker » pour confirmer que le déplacement maximum spécifié a été appliqué, et exportez les données vers un tableur approprié.

Pour évaluer l’étirement de la membrane de silicone après le traitement au plasma, placez la plaque sur une surface molle et apprêtez la petite saillie sur un tampon avec de l’encre provenant d’un marqueur permanent. Insérez le tampon dans le premier puits à tester, et tapotez pour assurer un bon transfert d’encre. Lorsque tous les puits ont été estampillés, placez une caméra à grande vitesse sur un support de perche au-dessus de l’appareil de blessure, avec l’objectif réglé sur le plus petit diaphragme numéroté de sorte que le champ de vision contienne 12 pénétrateurs dans une grille de 3 par 4.

Avec la plaque en position zéro, cliquez sur le bouton Enregistrer du logiciel de l’appareil photo pour qu’il indique « Trigger In » et allumez la lumière axiale brillante et diffuse, puis indentez la plaque comme nous venons de le démontrer, et éteignez la lumière axiale.

Pour endommager une culture cellulaire, ajoutez 100 microlitres de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines induites par la laminine dans chaque puits de la plaque traitée au plasma, et laissez les cellules se fixer au fond de la plaque pendant 15 minutes à température ambiante, avant de placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Après 2 à 3 jours de culture, fixez la plaque sur la platine du dispositif de blessure et ajustez la position du couvercle pour fixer la plaque sans exposer les cultures à l’air ambiant. Ensuite, avec la plaque en position zéro, indentez la plaque comme nous venons de le démontrer.