Mesure de l’activation des récepteurs odorisants à l’aide d’un dosage cyclique en temps réel de l’adénosine monophosphate

Prenez une plaque multipuits contenant des cellules de mammifères transfectées.

Ces cellules expriment le récepteur odorant (OR) du neurone olfactif, un récepteur couplé aux protéines G, ainsi qu’un biocapteur d’AMPc contenant un domaine de liaison à l’AMPc fusionné à une luciférase mutante.

Retirez le milieu et lavez-le avec un tampon pour éliminer le produit résiduel.

Ajoutez un tampon contenant un substrat de biocapteur cAMP. Incuber pour faciliter l’absorption du substrat dans les cellules.

À l’aide d’un lecteur de plaques de chimiluminescence, mesurez la luminescence basale des cellules.

Ajoutez des concentrations croissantes de l’odorisant d’essai dans les puits, en laissant un puits non traité comme témoin.

L’odorisant se lie à la salle d’opération et déclenche une cascade de signalisation qui produit une AMPc.

Cet AMPc se lie au domaine de liaison du biocapteur, activant la luciférase, qui interagit avec le substrat pour émettre de la lumière.

Mesurez la luminescence en temps réel. Une augmentation de la luminescence avec des concentrations plus élevées d’odorant indique l’activation de l’odorisant par l’OR.

Avant la stimulation, observez les cellules transfectées à l’aide