Mesure des niveaux d’acide rétinoïque dans les neurosphères à l’aide d’une lignée cellulaire rapporteure d’acide rétinoïque

Prenez une culture adhérente de cellules rapporteures d’acide rétinoïque (AR).

Ces cellules portent une construction transgénique contenant le gène lacZ, qui code pour la β-galactosidase, régulée par l’élément de réponse à l’acide rétinoïque (RARE).

Graines de cellules dissociées dérivées de neurosphères de cellules souches de moelle épinière de souris. Couver.

Les cellules de la neurosphère libèrent de la PR, qui pénètre dans les cellules rapporteures et se lie à son complexe récepteur lors de RARE.

Cela déclenche la formation d’un complexe activateur transcriptionnel, initiant l’expression de la β-galactosidase.

Remplacer le support par un fixateur pour préserver la morphologie cellulaire.

Retirez le fixateur et lavez-le avec un tampon.

Ajouter un tampon de perméabilisation pour perméabiliser les membranes cellulaires.

Introduire un substrat de β-galactosidase et incuber.

Le substrat pénètre dans les cellules rapporteures, où la β-galactosidase l’hydrolyse en un produit instable qui s’oxyde et se dimérise, formant un précipité de couleur bleue.

Laver avec un tampon.

À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez l’absorbance et comparez-la à une courbe standard pour quantifier la