Injection d’un vecteur viral dans la substance noire du rat pour la modélisation de maladies neurodégénératives

Fixez un rat anesthésié dans un cadre stéréotaxique.

Désinfectez le cuir chevelu et faites une incision médiane crânienne pour exposer le crâne.

Identifiez le bregma et le lambda, deux points de référence sur le crâne, pour déterminer le site d’injection.

Préparez une seringue de micro-injection contenant une suspension de vecteur viral.

Le vecteur viral est porteur d’un transgène codant pour l’alpha-synucléine, une protéine qui subit un mauvais repliement et une agrégation dans les neurones de la substance noire dans les maladies neurodégénératives.

Positionnez la seringue dans l’instrument stéréotaxique relié à une pompe de micro-injection.

Créez un trou de bavure au site d’injection, évitant ainsi les lésions cérébrales.

Pénétrez la dure-mère avec une aiguille et nettoyez le sang avec un tissu stérile.

Insérez l’aiguille de micro-injection dans le trou de la bavure pour atteindre la substance noire.

Injectez lentement la suspension virale en assurant une distribution uniforme.

Faites une courte pause pour éviter le reflux, puis retirez lentement l’aiguille.

Suturez l’incision.

Le modèle est maintenant prêt pour une analyse plus approfondie.

Commencez par anesthésier correctement une chatte Wistar de huit semaines selon les protocoles approuvés. Vérifiez qu’un plan chirurgical d’anesthésie a été réalisé en serrant chaque patte et en notant une absence de réflexe de retrait. Ensuite, utilisez un implanteur de microtranspondeur pour placer un microtranspondeur sur le dos du rat. Vérifiez que le microtranspondeur est correctement positionné et qu’une lecture peut être obtenue.

Maintenant, coupez les cheveux sur le cuir chevelu du rat et appliquez un anesthésique local sur le cuir chevelu et les oreilles. Transférez le rat dans une hotte à flux laminaire et effectuez le reste de la procédure en utilisant une technique aseptique. Placez le rat dans le cadre stéréotaxique en fixant les barres d’oreille, puis la barre buccale et nasale. Couvrez le corps du rat avec une couverture en papier pour éviter une baisse de la température corporelle. Appliquez un lubrifiant oculaire pour éviter que les yeux ne se dessèchent.

Ensuite, désinfectez le cuir chevelu selon les procédures approuvées. 1 % d’iode dans 70 % d’isopropanol est utilisé ici. Après avoir fait une petite incision dans la ligne médiane du cuir chevelu, grattez doucement les membranes du crâne et rincez avec une solution saline. Après avoir laissé sécher le crâne, assurez-vous que le bregma et le lambda sont clairement visibles.

Maintenant, remplissez une seringue de micro-injection de 10 microlitres, de calibre 30 et de 20 millimètres, avec un AAV recombinant, et placez-la sur la pompe de micro-injection motorisée connectée à l’instrument stéréotaxique.

Pour la transduction spécifique des neurones dopaminergiques de la substance noire, les vecteurs AAV recombinants sont le premier choix en raison de leurs titres élevés et de leur efficacité à transduire

Testez l’écoulement en libérant une goutte d’AAV. Jetez tout AAV libéré dans un détergent de nettoyage polyvalent. Vérifiez visuellement que la tête est fixée bien droite dans le cadre de la tête. Vérifiez ensuite que le crâne est plat en déplaçant d’abord la pointe de l’aiguille vers le bregma, et en mesurant la hauteur à ce point en abaissant la pointe de l’aiguille dans le sens dorso-ventral, jusqu’à ce qu’elle touche le crâne. Répétez la procédure à lambda.

Après avoir ramené l’aiguille dans la bregma, déplacez l’aiguille dans la direction antéropostérieure et médiolatérale vers les coordonnées stéréotaxiques pour la microinjection. Notez les coordonnées. Au site d’injection, mesurez la hauteur du crâne comme précédemment, et assurez-vous qu’elle ne diffère pas de plus de 0,3 millimètre de la hauteur de la bregma.

Ensuite, percez soigneusement un trou de 2 millimètres dans le crâne. Une fois le trou percé, mesurez la hauteur de la dure-mère pour déterminer la référence à partir de laquelle appliquer la coordonnée dorso-ventrale. Pénétrez la dure-mère à l’aide d’une aiguille de calibre 26. Absorbez tout sang avec un tissu stérile et ne procédez qu’après l’arrêt de tout saignement.

Maintenant, abaissez lentement l’aiguille de la seringue de micro-injection préchargée dans le cerveau jusqu’à la coordonnée ventrale dorsale et faites une pause d’une minute. Injectez ensuite trois microlitres d’AAV à raison de 0,25 microlitre par minute. Après l’injection, laissez l’aiguille en place pendant encore cinq minutes pour éviter le reflux le long de la piste de l’aiguille avant de la retirer lentement.

Cousez le cuir chevelu à l’aide de polyester tressé enduit 3.0, et désinfectez la peau avec 1 % d’iode dans 70 % d’isopropanol, pour desserrer la barre du nez et de la bouche, puis les deux barres d’oreille pour retirer délicatement l’animal de l’instrument stéréotaxique. À ce stade, administrez un analgésique et, si nécessaire, un agent d’inversion de l’anesthésie. Ensuite, placez le rat dans une cage propre sur une plaque chauffante réglée à 38 degrés Celsius et surveillez de près jusqu’à ce qu’il se réveille.