Isolement d’agrégats de protéines insolubles dans les détergents à partir de tissus cérébraux humains post-mortem

Commencez par un échantillon de tissu cérébral humain post-mortem congelé provenant d’un cas confirmé de maladie neurodégénérative.

Excise la matière grise riche en agrégats de protéines insolubles, une caractéristique de la maladie.

Transférez le tissu dans un homogénéisateur.

Ajouter un tampon contenant des inhibiteurs et homogénéiser pour libérer les composants intracellulaires.

Les inhibiteurs bloquent les enzymes protéase et phosphatase, empêchant la dégradation des protéines.

Transférez l’homogénat dans un tube et ajoutez un tampon de détergent ionique. Couver.

Le détergent solubilise les protéines repliées nativement, tandis que les agrégats de protéines mal repliés restent intacts.

Sonicate pour compléter la dissociation cellulaire.

Transférez l’homogénat dans un tube ultracentrifuge et centrifugez à grande vitesse.

Les agrégats se déposent au fond.

Retirez le surnageant contenant des protéines solubles dans les détergents.

Lavez les agrégats avec un tampon de détergent ionique, centrifugez-les et retirez le surnageant.

Ajoutez un tampon d’urée pour dénaturer les agrégats de protéines, les rendant solubles.

Transférez les agrégats de protéines solubilisées dans un tube et sonicate brièvement pour assurer une dissolution complète.

Obtenir du tissu cérébral post-mortem congelé à partir d’un témoin sain et d’une MA pathologiquement confirmée. À l’aide d’une pince et d’une lame de rasoir, on peut extraire environ 250 milligrammes de matière grise de chaque échantillon de tissu. Laissez le segment cérébral décongeler pendant une minute. Maintenant, coupez un morceau de tissu en morceaux cubes d’environ deux millimètres au fur et à mesure qu’il décongèle. Transférer dans un tube d’homogénéisation de deux millilitres pré-réfrigéré sur de la glace.

N’oubliez pas d’éviter la matière blanche et les gros vaisseaux sanguins.

Travaillez rapidement et placez le tissu sur des bateaux de pesée jetables en larmes. Prenez soin d’éviter que les tissus ne dégèlent en plaçant fréquemment le bateau de pesée avec du tissu cérébral dans des récipients en polystyrène avec de la glace sèche. Après avoir disséqué et pesé tous les morceaux de tissu requis, retirez un bateau de pesée contenant un morceau de tissu de la glace sèche.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres de tampon glacé à faible teneur en sel avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase par gramme de tissu, et homogénéisez sur de la glace en utilisant environ 10 coups de pilon A à dégagement élevé et 15 coups de pilon B à faible dégagement. Ensuite, utilisez une pipette Pasteur en verre de neuf pouces pour transférer chaque homogénat dans un tube en polypropylène de deux millilitres étiqueté. Aliquote l’homogénat restant dans des tubes de 1,5 millilitre étiquetés supplémentaires de la même manière pour un stockage à -80 degrés Celsius.

Pour procéder au fractionnement, ajoutez 100 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires et 100 microlitres de Sarkosyl à 10 % à chaque aliquote de 0,8 millimètre. Bien mélanger par inversion, puis incuber sur glace pendant 15 minutes. Après l’incubation, utilisez un sonicateur équipé d’une sonde à micro-pointes pour délivrer trois impulsions de 5 secondes à 30 % d’amplitude.

Après avoir utilisé la méthode de l’acide bicinchoninique pour déterminer les concentrations en protéines des homogénats, ajoutez à chaque échantillon un tampon de sark glacé avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase jusqu’à une concentration finale de 10 milligrammes par millimètre. Ensuite, transférez 500 microlitres de chaque échantillon dans des tubes ultracentrifuges en polycarbonate de 500 microlitres.

Chargez les tubes dans un rotor pré-refroidi et ultracentrifugez à 180 000 fois g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Après la centrifugation, transférez les surnageants solubles S1 sarkosyl dans des tubes de 1,5 millilitre et stockez-les à -80 degrés Celsius. Ajoutez 200 microlitres de tampon de sergot dans les tubes d’ultracentrifugation contenant les fractions P1 insolubles dans le détergent et utilisez la pointe de la pipette pour déloger les granulés du fond des tubes d’ultracentrifugation.

Ensuite, transférez les pastilles P1 remises en suspension dans de nouveaux tubes ultracentrifuges de 500 microlitres, associez la balance et centrifugez à 180 000 fois g pendant 30 minutes supplémentaires à 4 degrés Celsius. Jetez le surnageant S2, puis ajoutez 50 à 75 microlitres de tampon d’urée avec un cocktail inhibiteur de protéase et de phosphatase aux granules insolubles de sarkosyl et incubez pendant 30 minutes à température ambiante pour solubiliser la pastille P2.

Après l’incubation, transférez les pastilles P2 en suspension dans des tubes marqués de 0,5 millimètre et solubilisez complètement les pastilles à l’aide d’une brève sonication à micropointe de 1 seconde à une amplitude de 20 %. Déterminer les concentrations protéiques des fractions soluble et insoluble du sarkosyl à l’aide de la méthode de dosage BCA.