Étude de la perméation de la FITC et de la FITC-Ferritine à l’aide d’un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique

Commencez avec une plaque multipuits contenant un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique ou BHE.

Ce modèle se compose de cellules endothéliales collées à la face supérieure ou sanguine et d’astrocytes sur la face inférieure ou cérébrale d’un insert membranaire recouvert de matrice.

Ajoutez de l’isothiocyanate de fluorescéine ou FITC, un colorant fluorescent, dans la chambre supérieure d’un puits témoin.

À l’inverse, ajoutez de la ferritine chargée de FITC, ou FITC-ferritine, dans la chambre supérieure d’un puits d’échantillon, puis incuber.

Dans le puits témoin, le FITC libre reste confiné à la chambre supérieure, avec un passage minimal à travers la BHE.

Pendant ce temps, dans le puits de l’échantillon, les complexes FITC-ferritine se lient aux récepteurs des cellules endothéliales.

Cela permet l’internalisation et le transport médiés par le récepteur dans la chambre inférieure.

Ensuite, prélevez régulièrement le milieu dans les chambres inférieures des deux puits et mesurez l’intensité de la fluorescence.

Le témoin présente une fluorescence plus faible, tandis que l’échantillon présente une fluorescence plus élevée, confirmant la perméabilité différentielle de la BHE pour le FITC et la FITC-ferritine.

Pour mesurer le flux FITC-ferritine à travers le système de barrière hémato-encéphalique, ajoutez de la ferritine chargée de FITC ou du FITC libre à la partie supérieure d’au moins trois systèmes de barrière hémato-encéphalique pour chaque formulation.

Après sept heures dans un incubateur, prélever 2 millilitres de milieu des chambres inférieures de trois inserts d’échantillonnage et de contrôle. Mesurer l’intensité de fluorescence de 500 microlitres des échantillons collectés à l’aide d’un spectrofluorimètre et déterminer la concentration de FITC ou de FITC-ferritine perméée conformément aux instructions de la partie écrite du protocole.