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Prenez des tissus cérébraux de souris ischémiques perfusés contenant des cellules cérébrales et des cellules immunitaires infiltrées.
Émincez les mouchoirs sur une passoire et rincez avec un tampon.
Centrifuger le filtrat et jeter le surnageant.
Remettez la pastille en suspension dans une solution d’enzymes digestives et transférez-la dans un tube de microcentrifugation.
Incuber pour que les enzymes digestives décomposent la matrice extracellulaire, relâchant les cellules.
Filtrez la suspension et rincez-la avec un tampon contenant de la DNase pour éliminer l’ADN contaminant.
Ensuite, lavez avec un tampon sans DNase.
Centrifuger le filtrat et jeter le surnageant.
Remettez les cellules en suspension dans un milieu à gradient de densité. Ensuite, transférez le contenu dans un tube frais et mélangez. Centrifugeuse pour séparer les composants par densité.
Retirez le surnageant contenant la myéline et les débris.
Remettez le granulé en suspension dans un tampon sans DNase. Transférez-le dans un nouveau tube et centrifugez-le à nouveau.
Jeter le surnageant pour assurer une élimination suffisante du milieu à gradient de densité.
Enfin, mettez les cellules en suspension dans le tampon pour une analyse plus approfondie.
À l’aide de l’extrémité du piston d’une seringue de 5 millilitres, écrasez les morceaux de tissu cérébral à travers une passoire cellulaire de 100 microns, en rinçant continuellement la passoire avec du HBSS glacé avec du calcium et du magnésium. Placez ensuite les tissus homogénéisés sur de la glace.
Lorsque tous les échantillons ont été traités, faites tourner les suspensions cellulaires. Et jetez soigneusement les surnageants. Remettez les granulés en suspension dans 1 millilitre de tampon de digestion. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube de 2 millilitres.
Et incubez les cellules sous une rotation lente et continue à 37 degrés Celsius. Au bout d’une heure, tamisez la suspension cellulaire à travers une passoire à cellules de 70 microns. Et rincez abondamment le filtre avec 3 millilitres de tampon de lavage contenant de la DNase. Lavez ensuite la passoire avec 15 millilitres de tampon de lavage sans DNase. Faites tourner les cellules et jetez le surnageant.
Pour éliminer les débris cellulaires et la myéline, remettez les cellules en suspension dans 5 millilitres de milieu à gradient de densité de 25 % à température ambiante et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Mélangez soigneusement les cellules et le dégradé avec un pipetage doux répété. Ensuite, faites tourner la solution cellulaire.
À la fin de la séparation, aspirez soigneusement l’enveloppe de myéline et le surnageant sans perturber la pastille. Et mettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de tampon de lavage sans DNase. Transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres et faites-les tourner à nouveau, en remettant la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon de lavage à froid.