Immunocoloration des interneurones dans une coupe d’hippocampe de rat

Prenez une section d’hippocampe de rat fixe contenant un interneurone rempli de biocytine, une molécule conjuguée à la biotine.

Ensuite, ajoutez une solution contenant des protéines bloquantes et un détergent non ionique pour empêcher la liaison non spécifique et perméabiliser les neurones.

Incuber avec un anticorps primaire ciblant des récepteurs cannabinoïdes spécifiques sur les interneurones.

Laver avec un tampon pour éliminer l’excès d’anticorps.

Ensuite, ajoutez un colorant fluorescent conjugué à la streptavidine et un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore.

Pendant l’incubation, la streptavidine se lie fortement à la biocytine, ce qui permet de visualiser l’interneurone rempli de biocytine, tandis que l’anticorps secondaire cible les anticorps primaires liés aux récepteurs sur les interneurones.

Rincer avec un tampon en éliminant les molécules non liées.

Maintenant, montez la section à l’aide d’un support de montage aqueux. Placez une lamelle et scellez-la.

À l’aide d’un microscope à fluorescence, visualisez l’expression de l’interneurone et des récepteurs cannabinoïdes remplis de biocytines, ce qui permet d’analyser la morphologie de l’interneurone et la distribution des récepteurs.

Verrouillez les mouchoirs avec un sérum bloquant à 10 % pendant une heure à température ambiante. Par la suite, incubez les sections de l’anticorps primaire CB1R à température ambiante pendant la nuit, afin d’identifier l’expression du récepteur cannabinoïde de type un. Ensuite, lavez les sections de cerveau trois fois pendant 10 minutes chacune dans 0,1 PBS molaire. La streptavidine et l’anticorps secondaire contre le premier anticorps primaire sont tous deux ajoutés à la plaque du puits et conservés toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Par la suite, incubez les sections dans un colorant rouge streptavidine conjugué à quatre degrés Celsius pendant la nuit dans l’obscurité pour révéler la biocytine. Après cela, lavez les sections du cerveau trois fois pendant 10 minutes chacune dans 0,1 molaire PBS. Pour protéger la fluorescence et faciliter la recoloration à l’avenir, montez les sections dans un support de montage à base aqueuse et scellez les bords des lamelles avec du vernis à ongles transparent.