Induction d’une lésion neuronale ciblée à l’aide d’un laser de haute puissance chez une larve de drosophile

Placez une larve de drosophile anesthésiée la tête haute sur une goutte d’huile sur une lame de verre contenant des taches de graisse sous vide.

Positionnez une lamelle et appuyez doucement dessus pour entrer en contact avec la larve.

Ajustez la larve pour exposer la région contenant les neurones cibles exprimant des protéines fluorescentes.

Fixez la lame sur un microscope à deux photons.

Utilisez un laser de faible puissance pour minimiser les dommages et scannez la larve pour localiser la région avec les neurones cibles fluorescents.

Ensuite, ajustez la fenêtre de balayage pour vous concentrer sur la région cible contenant les axones, un type de projections neuronales.

Maintenant, réduisez la vitesse de balayage et augmentez la puissance du laser.

Le laser de haute puissance frappera les axones ciblés, générant une chaleur localisée qui les endommagera et améliorera la fluorescence autour du site de la blessure.

Enfin, revenez en mode laser basse consommation. La présence de petits cratères, de structures en forme d’anneau sur le site de la blessure confirme la réussite de la lésion neuronale.

Commencez par anesthésier les larves. Dans une hotte, placez un plat en verre de 60 millimètres dans une boîte de Pétri en plastique de 15 centimètres. Ensuite, pliez un morceau de papier de soie et placez-le dans le plat en verre. Placez la plaque de gélose au raisin sur le tissu après avoir ajouté l’éther diéthylique. Ensuite, sur une lame de verre, placez une goutte d’huile d’halocarbure 27 au centre et placez une tache de graisse sous vide sur chacun des quatre coins.

Ensuite, à l’aide d’une pince, transférez une larve sur la plaque de gélose et couvrez le plat en verre pour anesthésier la larve. Dès que la larve cesse de bouger, transférez-la soigneusement dans l’huile d’halocarbure avec la tête droite. Ensuite, placez une lamelle sur la lame et appuyez doucement dessus jusqu’à ce qu’elle touche la larve. Ensuite, utilisez une force douce pour faire glisser la lamelle afin de faire rouler les cellules à ablater jusqu’à l’endroit où le laser à deux photons les frappera le plus facilement. L’emplacement variera en fonction des neurones ciblés.

Maintenant, fixez l’assemblage sur la platine du microscope à deux photons et concentrez-vous sur les cellules d’intérêt à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile 40x. Dans le logiciel, passez en mode d’analyse et chargez le protocole enregistré. Assurez-vous que le sténopé est complètement ouvert. Ensuite, en mode Live, obtenez une bonne image de la région d’intérêt. Ensuite, arrêtez l’analyse en direct, afin que le bouton Recadrage devienne disponible. À l’aide de la fonction Recadrage, ajustez la fenêtre de balayage pour concentrer la zone cible uniquement sur le site potentiel de la blessure.

Ouvrez ensuite une nouvelle fenêtre d’imagerie. Maintenant, réduisez la vitesse de balayage et augmentez l’intensité du laser. Basculez ensuite le bouton continu pour démarrer et arrêter l’analyse. Regardez attentivement. Dès qu’il y a une augmentation drastique de la fluorescence, terminez le balayage. Ensuite, revenez à la fenêtre d’imagerie d’origine, sélectionnez le mode Live et recherchez la région qui vient d’être ciblée en ajustant la mise au point.

Une bonne indication d’une blessure réussie est l’apparition d’un petit cratère, d’une structure en forme d’anneau ou de débris localisés sur le site de la blessure. Si la puissance du laser était trop élevée, une grande zone de dommages serait visible, ce qui peut être mortel.