Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 2:19 min • July 8th, 2025
Commencez par une culture adhérente de neurones humains matures dans une plaque recouverte de matrice.
Ajouter des vecteurs lentiviraux codant pour une protéine tau humaine mutante fusionnée à un rapporteur de protéine fluorescente jaune (YFP).
Le lentivirus se fixe à des récepteurs spécifiques de surface des cellules neuronales, ce qui permet la fusion membranaire de l’hôte viral et la libération d’ARN viral et d’enzymes.
L’ARN viral est retranscrit en ADN.
L’intégrase virale transporte l’ADN dans le noyau, facilitant l’intégration dans le génome de l’hôte et conduisant à la production de la protéine tau mutante marquée YFP.
Au fil du temps, la protéine tau mutante forme des agrégats cytoplasmiques dans les cellules transduites.
Lavez les cellules avec un milieu frais pour éliminer les particules virales non internalisées.
Poursuivre l’incubation avec des changements réguliers de milieux pour maintenir la viabilité neuronale et favoriser l’agrégation des protéines.
Visualisez les neurones au microscope.
Les neurones transduits avec succès présentent des agrégats cytoplasmiques de protéine tau mutante fluorescente marquée YFP.
Pour transduire des neurones avec un lentivirus, utilisez un nombre de titres de 340 000 unités transductibles par cellule. Diluez les unités transductibles dans des milieux de culture cellulaire jusqu’à la concentration nécessaire et ajoutez-les aux cellules.
Deux jours après l’ajout du lentivirus, lavez une fois les cellules avec un milieu frais qui ne contient pas de bFGF.
Continuez à cultiver les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone dans des milieux sans bFGF. Conservez les cellules pendant environ huit semaines après la transduction, en vous assurant de changer le milieu de culture cellulaire tous les deux jours. Utilisez un microscope optique pour visualiser régulièrement les cellules et assurer leur viabilité.