Dosage de la luciférase pour mesurer l’activité de la γ-sécrétase dans les cellules humaines

Commencer avec des cellules humaines génétiquement modifiées dans un milieu de croissance.

Ces cellules contiennent un système inductible par la tétracycline possédant la protéine précurseur de l’amyloïde ou gène APP et un gène de la luciférase.

Échanger avec un milieu contenant de la tétracycline et incuber.

La tétracycline se lie à la protéine activatrice, qui se lie au promoteur APP.

Cela induit l’expression des gènes et produit les protéines précurseurs qui se localisent dans la membrane cellulaire.

L’enzyme β-sécrétase clive l’APP, générant un fragment qui reste attaché à la membrane cellulaire.

La γ-sécrétase clive ce fragment, produisant des peptides β amyloïdes et libérant un composant activateur.

Cet activateur pénètre dans le noyau, se lie au promoteur de la luciférase, induit l’expression des gènes et produit des enzymes luciférase.

Remplacez le milieu par un réactif de dosage contenant le substrat de la luciférase. Le substrat se diffuse dans les cellules et réagit avec la luciférase, produisant une bioluminescence.

À l’aide d’un lecteur de microplaques, vous mesurez l’intensité lumineuse, qui reflète directement l’activité de la γ-sécrétase, une enzyme cruciale dans les conditions neuropathologiques.

Comptez les cellules NG ou CG à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, ensemencez les cellules à raison de 20 000 cellules par puits sur des microplaques de 96 puits à un volume final de 200 microlitres par puits dans un milieu de croissance. Transférez les microplaques dans un incubateur de dioxyde de carbone humidifié et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après une nuit d’incubation, retirer 100 microlitres de milieu de croissance de chaque puits.

Ajouter 100 microlitres par puits de milieu de croissance contenant 2 microgrammes par millilitre de tétracycline avec soit 0,2 % de diméthylsulfoxyde, soit deux micromolaires CL 387, 785, deux micromolaires DAPT ou d’autres inhibiteurs ErbB1/ErbB2 apparentés. Incuber les cellules traitées dans des microplaques à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, prélever 150 microlitres par puits de milieu de croissance des microplaques.

Ajoutez ensuite 50 microlitres par puits de réactif de dosage de la luciférase. Ensuite, transférez les microplaques dans un lecteur de microplaques à luminescence et maintenez-les à température ambiante pendant cinq minutes. Déterminez la luminescence émise par la luciférase à l’aide d’un programme prédéfini stocké dans le lecteur de microplaques à luminescence.