Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 3:14 min • July 8th, 2025
Les régions du locus coeruleus, situées bilatéralement dans le tronc cérébral de la souris, contiennent des neurones producteurs de noradrénaline et régulent diverses régions du cerveau.
Pour détecter ces régions du locus coeruleus, commencez par utiliser une lame de verre portant les sections fixes et cryoconservées du tronc cérébral de la souris.
Lavez la lame avec un tampon pour éliminer les traces de fixateur.
Ajoutez un tampon contenant du détergent et incubez pour perméabiliser les membranes, puis lavez.
Introduire des anticorps primaires spécifiques de l’enzyme dopamine β-hydroxylase, qui convertit la dopamine en noradrénaline, un neurotransmetteur.
Incuber pour permettre aux anticorps d’interagir avec la dopamine β-hydroxylase.
Laver pour éliminer les anticorps non liés.
Ensuite, ajoutez des anticorps secondaires verts couplés à un fluorophore et incubez dans l’obscurité.
Les anticorps secondaires se lient aux anticorps primaires, puis se lavent.
Ajoutez du support de montage sur les sections cérébrales, puis couvrez et séchez.
Observez les lames au microscope à fluorescence.
La fluorescence verte représentant les neurones producteurs de noradrénaline marqués dans les sections du cerveau indique la présence de régions du locus coeruleus.
Le premier jour, lavez les tranches de cerveau dans la plaque à 24 puits 3 fois pendant 5 minutes chacune dans PBS. Ensuite, ajoutez 0,5 % de PBS avec un détergent et perméabilisez-les à 4 degrés Celsius pendant 24 heures.
Le lendemain, lavez les tranches trois fois pendant 5 minutes chacune avec 0,5 % de PBSD. Ensuite, ajoutez l’anticorps primaire à une dilution de 1 à 500 dans du PBSD à 0,5 %, et incubez à 4 degrés Celsius pendant 18 heures.
Le 3ème jour, lavez les tranches 3 fois pendant 10 minutes chacune avec 0,5 % de PBSD. Ensuite, ajoutez l’anticorps secondaire à une dilution de 1 à 1 000 dans du PBSD à 0,5 %. Enveloppez la plaque de papier d’aluminium et incubez à 4 degrés Celsius pendant 16 heures.
Après l’incubation, lavez les tranches 3 fois pendant 5 minutes chacune avec 0,5 % de PBSD, puis pendant 5 minutes dans du PBS. Couvrez les sections à l’aide d’un support de montage rigide sans DAPI. Couvrir d’un couvercle en verre et sécher pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, utilisez un microscope confocal avec des paramètres pour détecter le signal de la longueur d’onde de fluorescence appropriée, afin d’imager des tranches de cerveau.