Évaluation de la résistance électrique transendothéliale dans un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique

Commencez par un insert de membrane contenant des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de souris, ressemblant à une barrière hémato-encéphalique in vitro.

Placez cet insert dans un puits d’instrument à résistance électrique transendothéliale ou TEER contenant une électrode intégrée.

Ajoutez du fluide frais dans le compartiment inférieur.

Placez le couvercle avec des électrodes sur les puits TEER, puis placez l’instrument dans un incubateur et connectez-le à un système d’enregistrement.

Les électrodes génèrent un courant électrique à travers la couche cellulaire pour la mesure de la résistance transendothéliale.

Des protéines jonctionnelles intactes entre les cellules entravent la circulation du courant, ce qui entraîne une valeur TEER plus élevée.

Débranchez l’instrument et retirez-le.

Démontez le couvercle, retirez un peu de fluide du compartiment supérieur et ajoutez des lymphocytes T pré-activés. Remontez l’instrument pour la mesure TEER.

Les lymphocytes T activés interagissent avec les cellules endothéliales, libérant des facteurs inflammatoires et des enzymes cytolytiques, perturbant l’intégrité jonctionnelle.

Cette perturbation augmente le flux de courant électrique, ce qui entraîne une valeur TEER plus faible.

Pour configurer la mesure TEER, placez le module 24 puits de l’instrument TEER dans la hotte à flux laminaire. Retirez les couvercles et placez les inserts avec les MBMEC dans l’instrument à l’aide d’une pince.

Ensuite, pipetez 810 microlitres du milieu frais dans le compartiment inférieur des puits du module. Ajoutez-le soigneusement entre l’insert et la paroi du puits du module. Après cela, fermez les couvercles et placez l’instrument dans l’incubateur. Connectez l’instrument à l’ordinateur. Ensuite, allumez le contrôleur de l’instrument et ouvrez le logiciel.

Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez « Nouvelle mesure ». Cochez les cases « Afficher FEER » et « Afficher Ccl », puis appuyez sur « Démarrer ». Après avoir terminé la première mesure, sélectionnez « Vérifier tous les puits » dans l’onglet « résultats » pour voir toutes les valeurs TEER et Ccl. Enregistrez ensuite le fichier.

Ensuite, choisissez le moment de co-cultiver des MBMEC avec des lymphocytes T lorsque Ccl est stable et inférieur à 1 microfarad par centimètre carré et que TEER a atteint son niveau maximum. Inspectez soigneusement les valeurs absolues TEER et Ccl, et excluez les puits dans lesquels les MBMEC n’ont pas développé suffisamment de monocouches confluentes en décochant ces puits.

Regroupez le reste des puits en cliquant avec le bouton droit de la souris sur les puits et en sélectionnant « Ajouter un puits au nouveau puits moyen ». Nommez-le dans la fenêtre contextuelle et faites de même pour tous les puits individuels à regrouper. Ensuite, vérifiez tous les puits moyens pour confirmer qu’ils ont tous les mêmes conditions initiales avant la coculture.

Dans l’onglet « Expérience », appuyez sur « Pause ». Débranchez l’instrument et sortez-le de l’incubateur. Ensuite, retirez les couvercles de la hotte à flux laminaire. Par la suite, retirez une partie du fluide de l’insert au niveau du compartiment supérieur du puits. Ajoutez des lymphocytes T aux MBMEC en pipetant soigneusement 150 microlitres de milieu. Ensuite, rebranchez l’instrument et appuyez sur « Reprendre la mesure ». Après 24 heures, appuyez sur 'Stop' dans l’onglet 'Expérience' et enregistrez le fichier.