Mesure de l’absorption de la dopamine dans les synaptosomes cérébraux de souris à l’aide de dopamine radiomarquée

Récoltez des synaptosomes, des structures membranaires dérivées des terminaisons présynaptiques intactes des synapses neuronales qui contiennent des transporteurs de dopamine (DAT), à partir d’un cerveau de souris.

Remplissez les tubes à essai avec un tampon contenant des ligands et les tubes de référence avec un tampon contenant des ligands et un inhibiteur de DAT.

Ajoutez les synaptosomes.

Les ligands inhibent les enzymes dégradant la dopamine et d’autres transporteurs, empêchant la dégradation de la dopamine et l’absorption non spécifique.

Introduire de la dopamine non marquée et radiomarquée.

Dans les conditions d’essai, le DAT synaptosomal absorbe la dopamine.

Dans la condition de référence, l’inhibiteur empêche l’absorption de dopamine médiée par DAT, ne permettant que l’absorption de fond.

Ajoutez les échantillons dans des filtres en microfibres qui retiennent les synaptosomes.

Laver pour enlever la dopamine non liée.

Transférez les filtres dans des tubes à scintillation.

Ajouter un liquide à scintillation contenant un composé radiosensible.

Placez les tubes dans un comptoir à scintillation.

Les émissions radioactives de la dopamine incitent le composé à émettre de la lumière, qui est mesurée par le compteur.

Soustrayez la référence des données de test pour mesurer l’absorption synaptosomale de dopamine.

Dans cette étape, ajoutez 440 microlitres de tampon d’absorption, de ligand et de cocaïne à 12 tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre désignés, et 440 microlitres de tampon d’absorption et de ligand aux 36 tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre restants. Étiquetez 6 tubes de microcentrifugation de 2 millilitres comme 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 et 0,31. Ajoutez ensuite 750 microlitres de tampon d’absorption et de ligand dans les 5 tubes de microcentrifugation avec le nombre le plus bas.

Ensuite, ajoutez 1 455,4 microlitres de tampon d’absorption et de ligand, 14,6 microlitres de dopamine non étiquetée et 30 microlitres de dopamine tritiée dans le tube étiqueté 10. Ensuite, transférez 750 microlitres du mélange du tube étiqueté 10 au tube étiqueté 5. Mélangez bien et transférez 750 microlitres du mélange de ce tube vers le tube étiqueté 2.5. Répétez cette dilution avec les tubes restants.

Après cela, pré-rincez les filtres en microfibre de verre avec 4 millilitres de tampon d’absorption après les avoir placés sur un seau filtrant à 12 puits. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de suspension à membrane synaptosomale dans les 24 premiers tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant un tampon de 440 microlitres. Vortex avec précaution et tournez brièvement vers le bas pour vous assurer que les synaptosomes sont immergés dans le tampon.

Ensuite, laissez-les à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après 10 minutes, ajoutez 50 microlitres de dopamine de 10 micromolaires et 5 micromolaires aux 2 premières colonnes, et laissez-les à 37 degrés Celsius pendant 5 minutes en secouant. Après 5 minutes, arrêtez la réaction en ajoutant 1 millilitre de tampon d’absorption de froid glacé. Répétez l’opération avec les micromolaires 2,5 et les micromolaires 1,25, puis avec les micromolaires 0,62 et les micromolaires 0,31.

Ajoutez les échantillons dans les filtres en microfibre pré-rincés et lavez-les avec 5 x 4 millilitres de tampon d’absorption glacé. Une fois que les 12 premiers échantillons ont été ajoutés aux filtres, déplacez les filtres vers les tubes à scintillation. Répétez cette opération avec les 12 échantillons suivants. Préparez 3 tubes de comptage maximum en plaçant un filtre en microfibre au fond des tubes à scintillation 49 à 51, et en ajoutant 25 microlitres de la dopamine maximale de 10 micromolaires sur le dessus.

Ensuite, laissez les 51 tubes à scintillation dans une hotte pendant 1 heure. Ensuite, ajoutez 3 millilitres de liquide à scintillation dans chaque tube à scintillation et agitez vigoureusement sur un shaker pendant 1 heure. Pour compter la dopamine tritiée dans un compteur bêta pendant 1 minute, ouvrez le programme et choisissez les paramètres appropriés. Pour la détermination des protéines, utilisez un kit standard de dosage des protéines BCA pour déterminer les concentrations de protéines des synaptosomes afin de les ajuster et de comparer correctement l’absorption entre les échantillons.