Hybridation in situ à l’aide de sondes oligonucléotidiques pour étudier l’expression de l’ARN dans des sections de cerveau de rat

Prenez des sections cérébrales fixes d’un rat atteint du syndrome sérotoninergique, ce qui entraîne une altération de la synthèse de l’ARN du récepteur de la sérotonine dans les neurones.

Déshydratez les tissus à l’aide d’alcool. Appliquer une solution de prétraitement pour désactiver les enzymes d’hydrolyse endogènes, empêchant ainsi leur interaction avec les réactifs de détection.

Traiter avec un tampon bouillant pour rompre les réticulations induites par la fixation, exposant ainsi les ARN cibles.

Déshydratez le tissu, dessinez une barrière hydrophobe et incubez-le avec une solution pour perméabiliser les membranes cellulaires.

Ajoutez des sondes oligonucléotidiques et incubez, ce qui permet aux sondes de s’hybrider avec les ARN cibles.

Laver pour éliminer les sondes non liées, puis incuber avec des réactifs d’amplification contenant des sondes de préamplificateur, d’amplification et de marquage conjuguées aux enzymes qui se lient aux sondes oligonucléotidiques.

Incuber avec des substrats chromogènes qui sont hydrolysés par les sondes conjuguées aux enzymes, produisant une couleur visible.

Traitez avec du xylène pour augmenter la transparence des tissus, ajoutez un milieu de montage et appliquez une lamelle.

Au microscope, des taches colorées dans le tissu aident à quantifier l’expression de l’ARN cible.

Dans cette procédure, pour la déshydratation, prenez quatre lames pour les boîtes de lames de microscope stockées dans le congélateur à moins 80 degrés Celsius. Attribuez les sections aux tests des gènes ppiB, dapB et ht2a. Marquez-les et étiquetez-les avec un stylo à bille.

Ensuite, immergez les lames dans de l’alcool à 100 % à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, séchez les lames pendant cinq minutes dans la hotte. Pour le prétraitement, pipetez 20 microlitres du réactif de prétraitement dans chaque section.

Placez les diapositives sur un rail de rack dans un bac à humidité. Secouez doucement le plateau d’humidité sur un shaker horizontal à basse vitesse pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les lames deux fois avec de l’eau distillée deux fois pendant deux minutes. Immergez les lames dans un bécher de 1 000 millilitres contenant 450 millilitres du réactif de prétraitement 2.

Ensuite, faites bouillir les lames pendant un total de cinq minutes à 100 degrés Celsius pour restaurer la structure de l’ARN. Après cela, lavez les lames deux fois avec de l’eau distillée deux fois pendant deux minutes à chaque fois. Placez les lames dans de l’alcool à 100 % pendant cinq minutes.

Ensuite, faites sécher les lames pendant cinq minutes dans la hotte. À l’aide d’un stylo hydrophobe, dessinez un cercle autour de la zone sélectionnée dans la section du tissu. Ensuite, pipetez 10 microlitres du réactif de prétraitement dans chaque zone sélectionnée pour augmenter la pénétration de la sonde, et couvrez le bac à humidité avec un couvercle.

Ensuite, placez la plaque dans le four d’hybridation équipé d’un agitateur horizontal. Réglez la température du four à 40 degrés Celsius et secouez doucement la plaque pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les lames deux fois avec de l’eau distillée deux fois pendant deux minutes à chaque fois.

Dans cette étape, pipetez 10 microlitres de sonde ppiB, dapB ou htr2a sur les zones sélectionnées. Ensuite, couvrez le bac à humidité avec un couvercle pour éviter l’évaporation du réactif. Secouez doucement les lames sur l’agitateur horizontal à basse vitesse tout en les incubant à 40 degrés Celsius dans le four pendant deux heures.

Ensuite, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes à chaque fois. Pipette 10 microlitres de l’amplification 1 réactif sur chaque zone sélectionnée. Secouez et incubez les lames à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes à chaque fois.

Pipeter 10 microlitres du réactif d’amplification 2 sur chaque zone sélectionnée. Secouez et incubez les lames à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cela, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes à chaque fois.

Pipette 10 microlitres du réactif d’amplification 3 sur chaque zone sélectionnée. Secouez et incubez les lames à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes.

Pipette 10 microlitres du réactif d’amplification 4 sur chaque zone sélectionnée. Secouez et incubez les lames à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes.

Pipette 10 microlitres du réactif d’amplification 5 sur chaque zone sélectionnée. Secouez et incubez les lames à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes.

Pipeter 10 microlitres du réactif d’amplification 6 sur chaque zone sélectionnée. Agitez et incubez les lames à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, lavez à nouveau les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant deux minutes à chaque fois.

Maintenant, pipetez 10 microlitres du réactif rouge à chaque zone sélectionnée. Placez les lames dans le bac à humidité sur le shaker horizontal à température ambiante et secouez doucement à basse vitesse pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les lames deux fois avec de l’eau distillée deux fois pendant 10 minutes à chaque fois.

Faites sécher les lames à 60 degrés Celsius au four pendant 15 minutes. Après cela, placez les lames de xylène dans la hotte pendant cinq minutes. Ensuite, pipetez 20 microlitres de support de montage à base de xylène sur chaque zone sélectionnée et recouvrez avec une lamelle.