Coloration par immunofluorescence du cerveau de la drosophile pour l’imagerie unicellulaire des cellules gliales

Commencez par des cerveaux de mouches drosophiles transgéniques, contenant différents types de cellules gliales hébergeant un système de recombinase spécifique aux cellules.

Il entraîne l’expression d’une protéine de surface cellulaire fusionnée à différents épitopes antigéniques sur le même type de cellules.

Traitez le tissu avec un fixateur pour réticuler les protéines et préserver l’architecture tissulaire.

Laver pour enlever l’excès de fixateur.

Ajoutez des protéines bloquantes pour masquer les sites de liaison non spécifiques afin de réduire les taches de fond.

Incuber le tissu avec un cocktail d’anticorps primaires qui se lie aux différents épitopes exprimés sur les cellules gliales.

Laver pour éliminer les anticorps primaires non liés.

Incuber avec des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores qui se lient aux anticorps primaires.

Laver pour éliminer les anticorps secondaires non liés.

Montez le cerveau à l’intérieur d’une entretoise d’imagerie et placez une lamelle. L’espaceur crée une chambre pour le tissu, en préservant sa structure tridimensionnelle.

Différentes cellules du même type glial marquées avec différents anticorps conjugués aux fluorophores permettent de comprendre les interactions cellule-cellule.

Transférez les cerveaux isolés à l’aide d’une pointe de pipette P10 dans un tube de microcentrifugation de 200 microlitres avec une solution fixatrice. Ne manipulez jamais le cerveau à l’aide de pinces. Incuber les tissus à l’abri de la lumière. Évitez d’aspirer le cerveau pendant les transferts de solution.

Pour retirer le fixateur, utilisez trois lavages ou plus de 15 minutes avec une solution de lavage. Ensuite, bloquez les tissus avec une solution bloquante pendant 30 minutes ou plus. Ensuite, remplacez la solution bloquante par des anticorps primaires dilués dans une solution de lavage et incubez les cerveaux pendant la nuit à 4 degrés Celsius.

Pour éliminer les anticorps primaires, utilisez trois lavages de 1 heure dans une solution de lavage. Ensuite, ajoutez des anticorps conjugués aux fluorophores secondaires dans une solution de lavage et incubez les cerveaux pendant la nuit à 4 degrés Celsius ou pendant 4 heures à température ambiante. Pour éliminer complètement les anticorps non liés, utilisez trois lavages de 1 heure dans une solution de lavage, suivis d’un lavage plus long avec du PBS.

Ensuite, montez les cerveaux. Préparez deux lamelles à l’aide d’une entretoise d’imagerie. Dans l’entretoise, et sur la lamelle supplémentaire, appliquez 10 microlitres de support de montage avec un agent anti-décoloration. Ensuite, à l’aide d’une pipette P10, transférez les cerveaux dans la lamelle, en les déposant à côté du milieu avec un peu de PBS. Ne laissez pas le tissu se dessécher.

Maintenant, déplacez soigneusement les cerveaux dans le support de montage, à l’aide de la pipette. Et enfin, déplacez-les vers le support dans l’entretoise et disposez-les avec des pinces. Ensuite, retirez la doublure adhésive sur les entretoises et fixez une lamelle. Fixez la lamelle avec une légère pression à l’aide d’une pince et procédez immédiatement à l’imagerie.