Coloration par fluorescence de cellules de crête neurale cultivées sur des hydrogels de rigidité variable

Prenez des cultures de cellules de crête neurale adhérentes cultivées sur des lamelles recouvertes d’hydrogels de rigidité variable. Lavez les cellules avec un tampon.

Ajouter du paraformaldéhyde pour fixer les cellules et préserver la morphologie cellulaire.

Lavez les cellules avec un tampon pour éliminer tout excès de paraformaldéhyde.

Ensuite, ajoutez un détergent non ionique pour perméabiliser les membranes cellulaires.

Lavez les cellules avec un tampon pour éliminer l’excès de détergent.

Ensuite, introduisez une solution de blocage pour éviter les liaisons non spécifiques.

Incuber les cellules à l’aide d’une sonde d’actine filamenteuse de haute affinité qui se lie aux filaments d’actine.

Lavez les cellules avec un tampon pour éliminer toutes les sondes non liées.

Ajoutez un colorant nucléaire fluorescent pour colorer les noyaux, puis lavez avec un tampon pour éliminer l’excès de colorant.

Appliquez un milieu de montage sur les lamelles et examinez les cellules colorées au microscope à fluorescence.

Les cellules cultivées sur des hydrogels plus rigides présentent une formation accrue de filaments d’actine et une morphologie plus étalée que celles cultivées sur des hydrogels plus mous.

À l’aide d’une pince à épiler, transportez les lamelles sur une nouvelle plaque afin de minimiser les faux signaux provenant des cellules cultivées directement sur la plaque. Ensuite, fixez les cellules à l’aide de 500 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes, avant de traiter les cellules avec 500 microlitres de Triton X-100 à 0,1 % à température ambiante.

Après 15 minutes, bloquez les cellules avec 250 microlitres de sérum d’âne à 10 %. Colorer les cellules pour l’actine F avec de la phalloïdine à une dilution de 1 à 400 dans 250 microlitres de sérum d’âne à 10 %, suivie d’une incubation avec du DAPI pendant 10 minutes.

Lavez les cellules avec du PBS pendant deux minutes avant d’ajouter trois à quatre gouttes de milieu de montage dans chaque puits. Sur un microscope à fluorescence, capturez les images d’au moins trois images aléatoires par échantillon d’hydrogel produisant des canaux individuels et fusionnés.