Microdissection par capture laser pour isoler des cellules de Purkinje à partir d’un tissu cérébral humain post-mortem

Prenez un tissu cérébelleux humain post-mortem contenant les couches de cellules de Purkinje, de granules et de cellules moléculaires.

Placez-le sur un porte-échantillon de cryostat contenant un support d’enrobage partiellement congelé.

Laissez le média geler complètement, en fixant le tissu.

Transférez cet ensemble dans le bras de coupe du cryostat et laissez le tissu s’acclimater à la température du cryostat.

Rapprochez le tissu de la lame et coupez-le pour exposer les couches du cortex.

Placez une plaque anti-roulis au-dessus de la lame et obtenez des sections cérébelleuses.

Transférez ces sections sur une lame à membrane.

Incuber à des concentrations croissantes d’éthanol pour la fixation des tissus et la déshydratation.

Ensuite, incuber dans du xylène.

Séchez la lame et placez-la sur une platine de microscope à capture laser UV.

Placez le capuchon de collecte sur le tissu cérébelleux.

Au microscope, concentrez-vous sur les cellules de Purkinje.

À l’aide du laser, capturez et collectez les cellules de Purkinje pour une analyse plus approfondie.

Tout d’abord, coupez un petit morceau de tissu pour la section, en vous assurant que la section est composée d’environ 95 % de cortex cérébelleux. Remettez le reste des mouchoirs dans de la glace sèche ou dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, commencez à ajouter lentement de l’OCT sur le dessus du mandrin avec un mouvement circulaire lent. Accumulez des couches d’OCT jusqu’à ce qu’il y ait un monticule d’environ trois millimètres de haut recouvrant le mandrin.

Lorsque l’OCT est partiellement congelé, mais qu’il y a encore un peu de liquide au centre, placez les tissus sur le dessus du monticule. Laissez les mouchoirs reposer sur l’OCT pendant 1 à 2 minutes jusqu’à ce qu’il soit complètement congelé. Ensuite, transférez le mandrin avec l’OCT et le tissu congelés dans le bras de coupe du cryostat. Ajustez le mouchoir de manière à ce qu’il affleure la lame de coupe et laissez les mouchoirs reposer dans le bras de coupe pendant 20 minutes pour s’adapter à la nouvelle température.

L’étape la plus critique consiste à laisser le tissu s’acclimater dans le bras de coupe du cryostat aussi longtemps que nécessaire. Si les tissus se déchiquetent, la visualisation des cellules de Purkinje sera très difficile. Je recommande d’utiliser des morceaux de tissu plus petits et plus minces pour permettre au tissu de s’acclimater plus rapidement.

Après cela, rapprochez lentement le tissu de la lame. Une fois que le tissu a atteint la lame, commencez le processus de coupe. Coupez le tissu 2 à 3 fois jusqu’à ce que les couches du cortex soient visibles.

Ensuite, placez et alignez la plaque anti-roulis juste au-dessus de la lame du cryostat. Coupez 4 à 6 sections de 14 micromètres d’épaisseur, en notant que les sections correctement coupées seront plates sous la plaque anti-roulis. Alignez les sections coupées horizontalement sur l’étage du cryostat.

Inclinez une lame pour ramasser tous les morceaux de tissu, simultanément. Immédiatement après avoir sectionné le tissu, placez la lame dans un support de lame avec de l’éthanol à 70 % sur de la glace pendant 2 minutes. Transférez la diapositive dans un support de diapositive avec 95 % d’éthanol sur de la glace pendant 45 secondes.

Ensuite, placez la diapositive dans un support de diapositive avec de l’éthanol à 100 % à température ambiante pendant 2 minutes. Trempez la lame 3 fois dans le support de diapositive contenant du xylène numéro 1 à température ambiante. Ensuite, placez la diapositive dans un support de diapositive avec du xylène 2 à température ambiante pendant 5 minutes. Placez les lames dans une hotte propre et laissez-les sécher à l’air libre pendant au moins 30 minutes.

Tout d’abord, utilisez de la RNase décontaminée pour nettoyer la platine du microscope dans le bras de collecte du capuchon. Avec les mains gantées, placez la lame sur le microscope et un capuchon opaque de 500 microlitres dans le bras de collecte. À faible grossissement, alignez le capuchon opaque sur le tissu cérébelleux, en vous assurant que le capuchon couvre toute la zone visualisée dans l’oculaire.

Utilisez un objectif de 5 à 10 fois pour visualiser les couches cérébelleuses. Placez le curseur sur la section où la couche moléculaire et la couche de cellules granulaires se croisent. Déplacez-vous vers un grossissement de 40 fois et visualisez les cellules de Purkinje. Ensuite, commencez à les capturer.