Obtention d’une suspension unicellulaire à partir de tissu cérébral de rat congelé

Décongelez une section de tissu cérébral de rat congelé.

Ajoutez un tampon et émincez le tissu. Ensuite, transférez-le dans un tube contenant un tampon et mélangez.

Centrifugez le mélange et jetez le surnageant.

Ajoutez une solution enzymatique protéolytique au tissu et mettez-la en suspension à l’aide d’une pipette de grand diamètre.

Incuber le mélange pour décomposer la matrice extracellulaire, en desserrant les cellules neurales.

Centrifugez le mélange et jetez le surnageant.

Remettez en suspension les fragments de tissu dans un tampon réfrigéré et pipetez-les à plusieurs reprises pour dissocier les cellules.

Laissez les débris et les cellules non dissociées se déposer, puis transférez la suspension unicellulaire dans un nouveau tube.

Transférez les cellules dans de l’éthanol glacé et mélangez. Incuber pour fixer et perméabiliser les cellules.

Centrifugez la suspension et jetez le surnageant.

Remettez les cellules neurales en suspension dans un tampon froid pour une analyse plus approfondie.

Pour hacher le tissu, laissez les échantillons décongeler sur une plaque de verre froide pendant 1 minute maximum avant de les recouvrir d’une à deux gouttes de solution tampon A. Ensuite, en tenant une lame de rasoir complètement verticale par rapport à la plaque, hachez le tissu 100 fois dans chaque direction orthogonale. Pour hacher soigneusement le tissu, il est essentiel de garder le tissu humide avec le tampon A et de suivre les temps et la direction de hachage spécifiés.

Il est essentiel d’éliminer la majorité de la substance blanche lors de la dissection tissulaire et de garder le tissu recouvert de tampon A, afin d’améliorer l’efficacité du hachage et de maintenir la santé des cellules.

Lorsque le tissu a été soigneusement traité, utilisez la lame de rasoir pour transférer les morceaux dans un tube de microcentrifugation contenant 1 millilitre de tampon froid A, et retournez le tube trois à cinq fois pour immerger tout le tissu haché dans la solution. Pour dissocier les fragments de tissu en une suspension unicellulaire, granulez les échantillons par centrifugation.

Jetez le surnageant, puis ajoutez lentement 1 millilitre de solution enzymatique froide et fraîchement décongelée sur la paroi interne du microtube et utilisez une pipette de grand diamètre pour aspirer et distribuer immédiatement l’intégralité de chaque granule quatre fois pour disperser les morceaux de tissu hachés. Ensuite, retournez rapidement le microtube pour éviter que les pastilles ne collent au fond du tube, et incubez l’échantillon en le mélangeant bout à bout pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius.

À la fin de la digestion, centrifugez à nouveau le tube et ajoutez 0,6 millilitre de tampon froid A dans les cellules. À l’aide de la même pointe de pipette, aspirez et distribuez immédiatement les granulés cinq fois, puis sélectionnez une pipette en verre de 1,3 millimètre et utilisez-la pour titrer doucement les échantillons 10 fois.

Placez l’échantillon sur de la glace pendant 2 minutes pour permettre aux débris et aux cellules non dissociées de se déposer au fond du tube. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ensuite, transférez 800 microlitres de cellules du premier tube de surnageant collecté dans chacun des deux premiers tubes d’éthanol.

Retournez les tubes pour mélanger les échantillons. Placez ensuite les échantillons sur de la glace pendant 15 minutes avec mélange par inversion toutes les 5 minutes. À la fin de l’incubation, centrifugez les cellules. Ensuite, en touchant uniquement la paroi du microtube, utilisez une micropipette pour retirer lentement tous les microlitres de chaque surnageant, sauf les 50 derniers litres.