Immunohistochimie de coupes de tissu cérébral de souris pour cibler les neurones dopaminergiques

Prenez une lame recouverte de polymère avec des sections de tissu cérébral de souris contenant des neurones dopaminergiques exprimant la tyrosine hydroxylase, une enzyme clé pour la synthèse de la dopamine.
Tracez les coupes avec un stylo hydrophobe pour assurer une coloration uniforme.
Fixez le tissu dans une solution d’acétone-méthanol pour préserver la morphologie des tissus.
Rincez avec un tampon contenant un détergent pour perméabiliser les membranes cellulaires.
Incuber avec des anticorps primaires ciblant la tyrosine hydroxylase dans les neurones dopaminergiques, puis laver pour éliminer les anticorps non liés.
Ajouter des anticorps secondaires marqués à un colorant fluorescent, un colorant nucléaire et des inhibiteurs de RNase.
Pendant l’incubation, les anticorps secondaires se lient aux anticorps primaires, les colorants nucléaires marquent le noyau et les inhibiteurs de la RNase inactivent les RNases.
Rincer avec un tampon. Ensuite, déshydratez les sections de tissu à des concentrations croissantes d’éthanol.
Incuber dans du xylène pour éliminer le tissu.
Les sections de tissu traitées sont maintenant prêtes pour la microdissection par capture laser, ce qui permet une visualisation et une dissection précises des neurones dopaminergiques cibles.

Pour effectuer une immunohistochimie, utilisez un stylo hydrophobe pour délimiter les tissus et laissez-les sécher. Ensuite, dans une solution de méthanol à l’acétone 1 pour 1, fixez le tissu à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir sorti le tissu du congélateur, couvrez les sections avec 100 à 200 microlitres d’anticorps tyrosine hydroxylase dans du PBS et 1 % de triton pendant 10 minutes.

Ensuite, utilisez du PBS avec 1 % de triton pour rincer les lames avant de couvrir les sections avec 100 à 200 microlitres d’IgG antirabbit de chèvre, étiquetées avec Alexa Fluor 488. Incuber pendant cinq minutes, puis utiliser du PBS pour rincer les lames deux fois. Ensuite, déshydratez les échantillons dans une série graduée d’éthanol libre RNase pendant 30 secondes chacun, comme démontré précédemment dans cette vidéo. Incuber dans du xylène, pendant une minute et un deuxième lavage, pendant cinq minutes. Retirez les lames immédiatement avant de les utiliser pour LCM et laissez-les sécher à l’air.