JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 5:13 min • April 28th, 2025
Prenez une mouche aux yeux blancs, anesthésiée, transgénique et adaptée à l’obscurité.
La mouche exprime des canaux ioniques TRPL marqués eGFP dans les photorécepteurs de l’œil.
Dans l’obscurité, TRPL se localise dans les membranes des rhabdomères— les microvillosités des photorécepteurs.
À l’aide d’air comprimé, enfoncez la mouche la tête la première dans la pointe d’une pipette.
Coupez la pointe et poussez la braguette vers l’arrière.
Coupez-le à nouveau et poussez la braguette vers l’avant jusqu’à ce que seule sa tête ressorte.
Immobilise la pointe dans de la pâte à modeler collée à une lame et place-la sur une platine de microscope à fluorescence, l’œil faisant face radialement à l’objectif du microscope.
Ajoutez une goutte d’eau à l’objectif, puis abaissez-la jusqu’à ce qu’elle touche l’œil.
Capturer des images des photorécepteurs.
Mesurez les intensités de fluorescence dans les rhabdomères, le corps cellulaire et l’arrière-plan.
Illumine la mouche avec une lumière orange pour induire la translocation TRPL vers le corps cellulaire.
Répétez les mesures d’imagerie et de fluorescence.
Comparez les images pour observer une fluorescence rhabdomère réduite post-illumination, indiquant la translocation de TRPL vers le corps cellulaire.
Pour préparer une mouche dans une variante non létale, transférez la mouche anesthésiée à la glace la tête la première dans une pointe de pipette de 200 microlitres et poussez soigneusement la mouche vers la pointe avec de l’air comprimé. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, coupez la pointe de la pipette juste devant la tête. Et à l’aide d’une pince à épiler, enfoncez délicatement la mouche de quelques millimètres dans la pointe de la pipette.
Coupez à nouveau la pointe de la pipette. Et repoussez la mouche vers la pointe avec l’air comprimé, de sorte que seule la tête de la mouche dépasse de la pointe de la pipette. Après avoir collé un morceau de pâte à modeler sur une lame d’objet, appuyez sur la pointe de la pipette de manière à ce que l’œil gauche ou droit soit tourné vers le haut. Assurez-vous que l’œil est correctement orienté au microscope. Pour l’acquisition d’images, sélectionnez un objectif à immersion dans l’eau.
Dans le cas d’une variation non létale, utilisez une pipette de laboratoire pour coller une grosse goutte d’eau glacée sur la face inférieure de l’objectif d’immersion dans l’eau. Placez avec précaution la lame de l’objet avec la mouche préparée sur la platine du microscope. Ensuite, abaissez manuellement l’objectif d’immersion dans l’eau jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la surface de l’eau ou que l’œil de la mouche touche la goutte.
Ensuite, basculez le chemin de la lumière vers la caméra du microscope et générez une image en direct. Réajustez la mise au point de l’appareil photo et évaluez l’orientation de l’œil, en considérant que l’œil doit faire face radialement à l’objectif du microscope. Utilisez le logiciel de table de correspondance pour détecter la sursaturation.
Dans le cas des mouches non pigmentées, ajustez le temps d’exposition de sorte que les pixels les plus brillants soient juste en dessous de la limite de saturation pour chaque image. Enregistrez une image et enregistrez-la en tant que fichier brut pour archiver toutes les métadonnées correspondantes de l’enregistrement. Ensuite, exportez l’image au format TIFF point.
Pour quantifier la fluorescence relative de l’EGFP dans les rhabdomères des micrographies à immersion dans l’eau, ajustez les paramètres d’ImageJ en cliquant sur Analyser. Ensuite, définissez les mesures et cochez uniquement la case de la valeur de gris moyenne. Importez le point TIFF image en cliquant sur Fichier, puis Ouvrir. Choisissez une région représentative de l’image nette et agrandissez-la de 200 % à 300 % en appuyant plusieurs fois sur Ctrl et Plus.
Ensuite, sélectionnez l’outil Ovale. Et tout en appuyant sur la touche Maj, générez une sélection circulaire dans l’image qui est nettement plus petite qu’un rhabdomère fluorescent. Ensuite, recherchez la taille exacte affichée sous la barre d’outils dans la fenêtre principale d’ImageJ. Pour mesurer les intensités de fluorescence dans la sélection circulaire, déplacez le cercle vers le premier rhabdomère à l’aide des touches fléchées du clavier, puis cliquez sur Analyser, puis sur mesurer.
Une fenêtre de résultat répertoriant la valeur de gris mesurée s’affiche. Poursuivez avec les mesures des rhabdomères 2 à 6, et mesurez également le signal de fond. Dans le cas des mouches non pigmentées, effectuez des mesures supplémentaires des zones corporelles cellulaires correspondantes. Mesurer la fluorescence de deux autres ommatidies, ce qui a donné trois répliques techniques. Marquez les ommatidies analysées à l’aide de l’outil crayon et enregistrez cette image pour la documentation.
Sélectionnez et copiez les valeurs de gris mesurées à partir de la fenêtre de résultats et collez-les dans un tableur pour des calculs ultérieurs. Triez les valeurs d’intensité de fluorescence en fonction de leur origine dans le rhabdomère, le corps cellulaire et l’arrière-plan de la catégorie, et calculez l’intensité moyenne de chaque catégorie. Calculez ensuite la quantité relative d’EGFP présente dans le rhabdomère, en utilisant la première formule pour les yeux non pigmentés et la seconde pour les yeux pigmentés.