Détection des modifications des histones dans les cellules de levure avec surexpression de protéines neurodégénératives

Commencer par une suspension de cellules de levure surexprimant des protéines liées à des maladies neurodégénératives.

Cette protéine surexprimée est responsable de modifications dans les protéines d’emballage de l’ADN ou les histones avec des fractions chimiques.

Ajouter de l’hydroxyde de sodium et du bêta-mercaptoéthanol puis incuber sur de la glace.

L’hydroxyde de sodium et le bêta-mercaptoéthanol lysent les cellules, libérant les protéines intracellulaires, y compris les histones.

Centrifuge le lysat pour recueillir les protéines. Jetez le surnageant.

Ajoutez un colorant de chargement à la pastille de protéine et chauffez-la pour les dénaturer.

Chargez ces protéines dénaturées et un marqueur protéique sur le gel et l’électrophorèse pour les séparer par taille.

Électrotransfère les protéines sur une membrane, lave et ajoute un tampon de blocage pour empêcher la liaison non spécifique.

Ajouter des anticorps primaires qui se lient spécifiquement aux histones modifiées.

Laver pour éliminer les anticorps non liés et incuber avec des anticorps secondaires fluorescents, qui se lient aux anticorps primaires.

Une bande fluorescente distincte confirme les modifications des histones, indiquant une surexpression des protéines neurodégénératives.

Pour lyser les cellules pour l’analyse par western blot, décongelez les pastilles de cellules de levure sur de la glace avant de les remettre en suspension dans 100 microlitres d’eau distillée. Ajoutez 300 microlitres d’hydroxyde de sodium 0,2 molaire et 20 microlitres de 2-Mercaptoéthanol à chaque échantillon de cellule. Et remettre les granulés en suspension par pipetage.

Après une incubation de 10 minutes sur glace, granulez les cellules par centrifugation et remettez les échantillons en suspension dans 100 microlitres de colorant de chargement. Faites ensuite bouillir les échantillons pendant 10 minutes sur un bloc chauffant. Pendant que les échantillons sont lysés, placez deux gels dans un support de gel et remplissez la chambre intérieure jusqu’en haut avec un tampon courant et la chambre extérieure jusqu’à la marque de ligne à deux gels.

Lorsque les échantillons sont prêts, chargez 15 microlitres de chaque solution de lyse cellulaire dans chaque puits du gel de polyacrylamide à 10 puits à 12 % et ajoutez 5 microlitres d’échelle protéique dans le puits de la voie de l’échelle protéique. Faites fonctionner le gel pendant environ 45 minutes à 150 volts ou jusqu’à ce que le front de chargement du colorant atteigne le bas du gel.

Pendant que le gel fonctionne, trempez deux tampons de fibres par gel dans un tampon de transfert et une membrane de fluorure de polyvinylidène ou de PVDF par gel dans du méthanol. Lorsque le gel est prêt, rincez la membrane et le tampon de transfert. Et placez un tampon de fibre pré-trempé au fond d’une cellule d’appareil de transfert semi-sec, suivi de la membrane PVDF, du gel et du deuxième tampon de fibre pré-trempé.

Réglez ensuite la puissance sur 150 milliampères pendant 1 heure. À la fin du transfert de protéines, retirez la membrane de l’appareil de transfert pour un bref rinçage à l’eau distillée. Placez la membrane rincée côté protéine vers le haut dans une petite boîte de coloration et couvrez la membrane avec une solution saline tamponnée au Tris ou un tampon bloquant le TBS pour une incubation de 1 heure à température ambiante avec un balancement doux.

À la fin de l’incubation bloquante, incuber la membrane pendant la nuit avec une histone anti-levure et un anticorps spécifique de modification dans le TBS à 4 degrés Celsius, et un anticorps de contrôle de la charge nucléaire approprié.

Le lendemain matin, laver la membrane quatre fois dans du TBS, complété par du polysorbate 20 à 0,1 % pendant cinq minutes avec un balancement à température ambiante par lavage. Après le dernier lavage, incubez le transfert avec les anticorps secondaires appropriés pendant 1 heure à température ambiante, suivi de quatre lavages de 5 minutes dans le TBST et d’un lavage de cinq minutes dans le TBS seul avec basculement.

Ensuite, imagez le transfert sur un système d’imagerie fluorescent par transfert Western pendant 2 minutes.