Détection de la protéine α-synucléine associée à une maladie neurodégénérative à l’aide d’un ELISA

Commençons par le tissu cérébral d’une souris transgénique surexprimant la α-synucléine mutée, une protéine neuronale mal repliée associée à une maladie neurodégénérative, immergée dans un tampon à haute teneur en sel.

Homogénéisez le tissu à l’aide d’un grand pilon, suivi d’un petit pilon pour perturber le tissu et libérer des protéines intracellulaires, y compris la α-synucléine.

Transférez l’homogénat dans un tube et centrifugez. Prélever le surnageant contenant des protéines et le diluer avec un tampon.

Ajoutez ce surnageant à une microplaque enrobée d’anticorps spécifiques à la α-synucléine prétraitée avec un agent bloquant pour empêcher la liaison non spécifique.

Incuber avec agitation, permettant à la α-synucléine normale et mutée de se lier.

Laver la plaque, puis ajouter les anticorps de détection spécifiques de la α-synucléine mutée et incuber avec agitation.

Laver à nouveau et ajouter des anticorps liés à des enzymes, puis incubation sous agitation.

Ajouter le substrat et incuber dans l’obscurité sous agitation. Le substrat réagit avec l’enzyme pour produire un changement de couleur.

Arrêtez la réaction avec un acide et mesurez l’absorbance pour quantifier la α-synucléine mutée.

Pour préparer des homogénats cérébraux, ajoutez un volume adéquat de tampon HS aux régions cérébrales disséquées pour atteindre un pourcentage d’homogénat attendu, comme indiqué dans le tableau ci-dessous. À l’aide d’un broyeur de tissus composé d’un tube de verre borosilicaté et de deux pilons, A et B, versez une région du cerveau à écraser dans le tube. Et puis avec le pilon A, homogénéisez le tissu 10 fois pour le dissocier.

Ensuite, passez au pilon B et homogénéisez 20 fois supplémentaires. À l’aide d’une pipette de transfert, transférez l’homogénat dans un tube de 1,5 millilitre, en répétant l’homogénéisation avec les échantillons de cerveau restants. Centrifugez les échantillons à 1 000 g pendant cinq minutes, à quatre degrés Celsius. Ensuite, collectez les surnageants et divisez-les en aliquotes de 200 microlitres.

Avec 100 microlitres de solution d’enrobage d’anticorps, enduisez les puits de microplaques à 96 puits et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez 300 microlitres de PBST dans les puits et utilisez un laveur de plaques pour laver les plaques cinq fois. Tout en travaillant à température ambiante, en avançant, ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage T20 PBS dans chaque puits et secouez les plaques à 150 tr/min pendant une heure avant d’utiliser PBST pour laver les plaques cinq fois.

En utilisant le PBST, 1 % de BSA, diluez les homogénats cérébraux en suivant les directives énumérées ici. Et ajoutez 100 microlitres dans chaque puits. Ensuite, incubez à température ambiante et à 150 tr/min pendant deux heures avant d’utiliser PBST pour laver les assiettes cinq fois.

Après le lavage final, ajouter les anticorps nécessaires de détection de l’alpha-synucléine dilués dans du PBST et 1 % de BSA comme indiqué dans le tableau deux du protocole textuel. Incuber à température ambiante et à 150 tr/min pendant une heure avant de laver les assiettes cinq fois comme auparavant.

Ensuite, ajoutez des conjugués IGG HRP anti-souris ou anti-lapin dilués à 1 à 8 000 dans PBST, 1 % BSA. Et incubez à 150 tr/min pendant une heure avant de laver les assiettes cinq fois. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution TMB dans chaque puits et incubez à 150 tr/min pendant 15 minutes dans l’obscurité. Arrêtez la réaction en ajoutant 100 microlitres d’un acide chlorhydrique normal par puits. Ensuite, utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer l’absorbance à 450 nanomètres.