Détection de la protéine α-synucléine associée à une maladie neurodégénérative à l’aide d’un ELISA
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 4:37 min • April 28th, 2025
Commençons par le tissu cérébral d’une souris transgénique surexprimant la α-synucléine mutée, une protéine neuronale mal repliée associée à une maladie neurodégénérative, immergée dans un tampon à haute teneur en sel.
Homogénéisez le tissu à l’aide d’un grand pilon, suivi d’un petit pilon pour perturber le tissu et libérer des protéines intracellulaires, y compris la α-synucléine.
Transférez l’homogénat dans un tube et centrifugez. Prélever le surnageant contenant des protéines et le diluer avec un tampon.
Ajoutez ce surnageant à une microplaque enrobée d’anticorps spécifiques à la α-synucléine prétraitée avec un agent bloquant pour empêcher la liaison non spécifique.
Incuber avec agitation, permettant à la α-synucléine normale et mutée de se lier.
Laver la plaque, puis ajouter les anticorps de détection spécifiques de la α-synucléine mutée et incuber avec agitation.
Laver à nouveau et ajouter des anticorps liés à des enzymes, puis incubation sous agitation.
Ajouter le substrat et incuber dans l’obscurité sous agitation. Le substrat réagit avec l’enzyme pour produire un changement de couleur.
Arrêtez la réaction avec un acide et mesurez l’absorbance pour quantifier la α-synucléine mutée.
Pour préparer des homogénats cérébraux, ajoutez un volume adéquat de tampon HS aux régions cérébrales disséquées pour atteindre un pourcentage d’homogénat attendu, comme indiqué dans le tableau ci-dessous. À l’aide d’un broyeur de tissus composé d’un tube de verre borosilicaté et de deux pilons, A et B, versez une région du cerveau à écraser dans le tube. Et puis avec le pilon A, homogénéisez le tissu 10 fois pour le dissocier.
Ensuite, passez au pilon B et homogénéisez 20 fois supplémentaires. À l’aide d’une pipette de transfert, transférez l’homogénat dans un tube de 1,5 millilitre, en répétant l’homogénéisation avec les échantillons de cerveau restants. Centrifugez les échantillons à 1 000 g pendant cinq minutes, à quatre degrés Celsius. Ensuite, collectez les surnageants et divisez-les en aliquotes de 200 microlitres.
Avec 100 microlitres de solution d’enrobage d’anticorps, enduisez les puits de microplaques à 96 puits et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez 300 microlitres de PBST dans les puits et utilisez un laveur de plaques pour laver les plaques cinq fois. Tout en travaillant à température ambiante, en avançant, ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage T20 PBS dans chaque puits et secouez les plaques à 150 tr/min pendant une heure avant d’utiliser PBST pour laver les plaques cinq fois.
En utilisant le PBST, 1 % de BSA, diluez les homogénats cérébraux en suivant les directives énumérées ici. Et ajoutez 100 microlitres dans chaque puits. Ensuite, incubez à température ambiante et à 150 tr/min pendant deux heures avant d’utiliser PBST pour laver les assiettes cinq fois.
Après le lavage final, ajouter les anticorps nécessaires de détection de l’alpha-synucléine dilués dans du PBST et 1 % de BSA comme indiqué dans le tableau deux du protocole textuel. Incuber à température ambiante et à 150 tr/min pendant une heure avant de laver les assiettes cinq fois comme auparavant.
Ensuite, ajoutez des conjugués IGG HRP anti-souris ou anti-lapin dilués à 1 à 8 000 dans PBST, 1 % BSA. Et incubez à 150 tr/min pendant une heure avant de laver les assiettes cinq fois. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution TMB dans chaque puits et incubez à 150 tr/min pendant 15 minutes dans l’obscurité. Arrêtez la réaction en ajoutant 100 microlitres d’un acide chlorhydrique normal par puits. Ensuite, utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer l’absorbance à 450 nanomètres.
Aperçu
Cet article présente un protocole détaillé permettant de détecter l'α-synucléine associée aux maladies dans des tissus cérébraux de souris transgéniques surexprimant l'α-synucléine humaine mutée A53T, en utilisant une méthode d'ELISA améliorée. La procédure permet une quantification sensible des formes normales et mutées de l'α-synucléine, ce qui est pertinent pour la recherche sur les maladies neurodégénératives.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Recherche sur les maladies neurodégénératives
- Biochimie des protéines
Contexte
- La protéine α-synucléine est une protéine neuronale impliquée dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson.
- Des mutations telles que A53T dans l'α-synucléine sont associées à la pathologie de la maladie.
- La quantification de l'α-synucléine associée à la maladie dans le tissu cérébral est importante pour comprendre les mécanismes et la progression de la maladie.
- L'ELISA constitue une méthode sensible et spécifique pour la détection de protéines dans des échantillons biologiques.
Objectif de l'étude
- Établir un protocole fiable pour la détection et la quantification de l'α-synucléine mutée dans le tissu cérébral de souris.
- Permettre la distinction entre les formes normales et celles associées à la maladie de l'α-synucléine.
- Fournir une méthode reproductible utilisable dans les modèles de maladies neurodégénératives.
Méthodes utilisées
- Disséction et homogénéisation de tissu cérébral provenant de souris transgéniques dans un tampon à haute teneur saline à l’aide de baguettes en verre.
- Centrifugation pour séparer le surnageant contenant les protéines et préparation d’aliquots.
- Revêtement de microplaques de 96 puits avec des anticorps spécifiques de l’α-synucléine et blocage pour empêcher la liaison non spécifique.
- Incubation d’homogénats cérébraux dilués dans les puits revêtus, suivie d’incubations séquentielles avec des anticorps de détection et des anticorps secondaires marqués par une enzyme.
- Détection colorimétrique à l’aide du substrat TMB et mesure de l’absorbance à 450 nm pour quantifier les niveaux d’α-synucléine.
Résultats principaux
- Le protocole permet une détection sensible de l'α-synucléine normale et mutée dans des homogénats cérébraux de souris.
- Le dosage immuno-enzymatique amélioré permet la quantification des formes d'α-synucléine associées à la maladie.
- La méthode démontre une spécificité grâce à l'utilisation d'anticorps de détection spécifiques aux mutations.
- Les résultats peuvent être utilisés pour comparer les niveaux d'α-synucléine entre différents groupes expérimentaux ou modèles de maladie.
Conclusions
- Ce protocole ELISA amélioré offre une approche fiable et sensible pour la détection de l'α-synucléine associée aux maladies dans les tissus cérébraux.
- La méthode convient aux études qui examinent le rôle de l'α-synucléine dans les maladies neurodégénératives.
- Elle permet une analyse quantitative de la pathologie protéique dans les modèles de souris transgéniques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La détection quantitative de l'α-synucléine associée aux maladies à l'aide d'un ELISA permet une validation ciblée robuste et une réduction des risques mécanistiques dans la recherche sur les maladies neurodégénératives. Ce flux de travail soutient la confiance prédictive aux points critiques de la découverte précoce et du stade préclinique, éclairant ainsi les décisions portant sur les portefeuilles de programmes thérapeutiques ciblant les protéinopathies. La mesure fiable des niveaux d'α-synucléine mutée dans des modèles transgéniques soutient la continuité translationnelle de la découverte à la validation préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet d'étudier l'α-synucléine comme cible pertinente dans les modèles de neurodégénérescence.
- Facilite la détection biologique des risques en distinguant les formes normales des formes mutées de la protéine.
- Fournit des données quantitatives permettant une prédiction fiable des études d'engagement de la cible.
Tests et développement de tests
- Fournit des résultats d'ELISA validés et reproductibles pour le criblage de composés en aval.
- Facilite la standardisation et l'évolutivité des tests dans différents groupes expérimentaux.
- Permet une comparaison fiable des niveaux d'α-synucléine entre les groupes expérimentaux.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur la quantification de biomarqueurs pertinents pour la maladie dans des modèles de souris transgéniques.
- Permet la continuité du stade de découverte précoce jusqu'à la validation préclinique des hypothèses thérapeutiques.
- Éclaire les décisions d'avancement ajustées au risque en se basant sur la pathologie protéique quantitative.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode de détection basée sur le ELISA s'intègre dans la continuité découverte-préclinique des programmes relatifs aux maladies neurodégénératives.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification quantitative de l'implication de l'α-synucléine dans des modèles de maladie.
- Écrantage : Fournit des résultats d'essai quantitatifs et reproductibles pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Permet la mesure, basée sur l'absorbance, des niveaux protéiques en vue de comparaisons statistiques.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes fondamentales à la validation préclinique de biomarqueurs dans des modèles pertinents.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme standardisée et adaptable pour la quantification de protéines dans diverses chaînes de recherche sur les maladies neurodégénératives.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des protocoles de détection des protéines.
- Valeur stratégique : Permet une meilleure prise de décision quant aux poursuites ou interruptions de projets et une utilisation plus efficace du capital en fournissant des données quantitatives solides.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation et l'avancement, ajustées au risque, des actifs dédiés aux maladies neurodégénératives.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biochimie des protéines et en développement de tests ELISA.
- Suppose l'accès à des lecteurs de microplaques, à des anticorps validés et à des réactifs standardisés.
- Exige une standardisation rigoureuse entre équipes des protocoles d'homogénéisation et de dosage.
- Peut être adapté à divers systèmes modèles transgéniques ou pertinents pour des maladies, selon le choix des anticorps.
- Dépend d'une préparation précise des échantillons et de contrôles rigoureux d'incubation pour des résultats reproductibles.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026