Analyse LC-MS/MS du profil protéomique de granules de neuromélanine isolés dans le tissu cérébral humain

Commencer avec des peptides dérivés de granules de neuromélanine (NMG) isolés de tissu cérébral humain post-mortem.

Les NMG, présents dans les neurones producteurs de dopamine, contiennent des pigments, des protéines et des lipides de neuromélanine.

Prenez une colonne de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) contenant une phase stationnaire à base de silice fonctionnalisée avec des ligands hydrophobes.

Charge les peptides sur la colonne.

Les peptides hydrophobes se lient plus fortement à la colonne que les peptides hydrophiles.

Passe un tampon d’élution à travers la colonne.

Les peptides moins hydrophobes éluent en premier, tandis que les peptides plus hydrophobes éluent plus tard.

Les peptides élués entrent dans la source d’ionisation par électronébulisation du spectromètre de masse, où ils sont ionisés en ions peptidiques chargés.

Les peptides ionisés entrent ensuite dans l’analyseur de masse, où ils sont séparés en fonction de leurs rapports masse/charge.

Un ion peptidique sélectionné est dirigé vers la cellule de collision et fragmenté en ions plus petits, dont les rapports masse/charge sont à nouveau mesurés.

Enfin, les données sont comparées à une base de données de référence pour identifier les protéines présentes dans l’échantillon de NMG.

Après avoir effectué la digestion tryptique, comme décrit dans le texte, préparez l’échantillon pour l’analyse HPLC-MS en dissolvant 200 à 400 nanogrammes de peptides d’échantillon dans un volume défini de 0,1 % de TFA dans des entrées de flacons en verre de spectrométrie de masse inerte. Si la détermination de la concentration n’est pas applicable en raison d’une faible quantité d’échantillon, vérifiez la charge identique de l’échantillon en comparant le courant ionique total.

Pour commencer l’analyse protéomique des données brutes, cliquez sur Charger pour charger les fichiers bruts dans le logiciel. Cliquez sur Set Experiment pour attribuer les noms des échantillons. Pour définir des paramètres spécifiques à un groupe, ajoutez les modifications en choisissant Déamidation NQ, Oxydation M et Carbaminométhylation N-Term comme modifications de variable. Et puis ajoutez la carbaminométhylation C comme modification fixe. Choisissez la trypsine comme enzyme de digestion dans l’onglet digestion.

Dans l’onglet Quantification sans étiquette. Ajoutez l’option, LFQ. Et si plus de 10 fichiers doivent être traités, choisissez l’option LFQ rapide pour raccourcir le temps de traitement. Pour vous assurer que tous les autres paramètres spécifiques au groupe restent dans les paramètres d’usine, passez à l’onglet Paramètres globaux et ajoutez le fichier FASTA dérivé de uniprot.org dans l’onglet Séquences. Modifiez la règle d’identification en conséquence et ajoutez l’ID de taxonomie 9606 pour Homo sapiens.

Pour la quantification des protéines, choisissez des peptides uniques et des peptides de rasoir. Ensuite, ajoutez l’option iBAQ comme mesure de la quantification des protéines dans l’onglet Quantification sans étiquette. Assurez-vous que tous les autres paramètres globaux restent dans les paramètres d’usine, puis cliquez sur Démarrer. Une fois l’analyse effectuée avec succès, récupérez la sortie .txt du groupe protéique.