Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 3:01 min • April 28th, 2025
Commencez avec une plaque multi-puits à fond plat recouverte d’une matrice de membrane basale, qui contient un polymère extracellulaire et des protéines d’adhésion qui imitent la matrice du microenvironnement tumoral.
Introduisez un média contenant une neurosphère de cellules de gliome dérivées d’une tumeur cérébrale pédiatrique, en vous assurant qu’elle est positionnée au centre du puits.
La matrice favorise l’attachement de la neurosphère au puits.
Ajouter un réactif de suppression d’arrière-plan pour minimiser la fluorescence non spécifique.
Ensuite, introduisez des anticorps anti-CD44 conjugués au fluorophore vert.
Transfère la plaque dans un système d’imagerie de cellules vivantes logé dans un incubateur qui maintient les conditions physiologiques de la cellule.
Au fil du temps, les cellules de gliome expriment la protéine d’adhésion cellulaire CD44, qui interagit avec les protéines d’adhésion.
Cela active la voie de signalisation cellulaire et facilite la migration cellulaire de la neurosphère.
Les anticorps anti-CD44 conjugués aux fluorophores se lient au CD44 exprimé sur les cellules de gliome, les rendant fluorescentes.
L’apparition de cellules fluorescentes vertes s’éloignant de la neurosphère confirme la migration des cellules de gliome.
Une fois que les puits sont recouverts de BMM, coupez une pointe P200. Prenez 50 microlitres de milieu cellulaire et de NS de chaque puits sélectionné et transférez-le dans un puits à fond plat et enduit. Vérifiez visuellement la présence et la position du NS dans chaque puits. Ajoutez doucement 50 microlitres d’anticorps BSR et ALR dilués dans chaque puits, en attendant deux à trois minutes pour laisser les réactifs se mélanger. Et à l’aide d’un microscope inversé, assurez-vous que la plupart des NS répliqués sont situés au centre du puits. Après s’être assuré de l’absence de bulle, transférez doucement la plaque dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes comme démontré précédemment.
Sur le logiciel de l’instrument d’analyse de cellules vivantes, sélectionnez l’option Planifier l’acquisition. Ensuite, cliquez sur l’onglet plus et sélectionnez Scanner selon le calendrier pour numériser les plaques avec les intervalles mentionnés dans le manuscrit de texte. Dans la fenêtre du logiciel, créez ou restaurez un navire, puis cliquez sur l’option Nouveau. Sélectionnez le type de balayage Clonage par dilution, l’objectif 4X et la phase et le vert pour le test de migration. Sélectionnez le type de plaque et définissez les puits à scanner en les mettant en surbrillance sur la carte des plaques. Ensuite, configurez la fréquence d’analyse. Cliquez sur Ajouter au programme et lancez l’analyse.