Caractérisation des sphéroïdes tumoraux neuroendocriniens de l’intestin grêle à l’aide de l’immunofluorescence

Prenez des sphéroïdes de la tumeur neuroendocrine de l’intestin grêle dans un tube.

Ajoute une solution fixatrice pour préserver les cellules.

Pour laver, centrifuger et remplacer le fixateur par un tampon.

Centrifuge et jette le surnageant pour éliminer tout fixateur restant.

Ajouter un tampon contenant un détergent et un agent bloquant pour perméabiliser les membranes cellulaires et empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Laver avec un tampon pour éliminer l’excès de détergent et d’agent bloquant.

Incuber avec des anticorps primaires, qui se lient à la protéine cible spécifique de la cellule neuroendocrine.

Laver avec un tampon pour éliminer les anticorps non liés.

Ajouter des anticorps secondaires marqués au fluorophore qui se lient aux anticorps primaires.

Rincer avec un tampon pour éliminer l’excès d’anticorps.

Ajouter un support de montage contenant un colorant pour colorer le noyau.

Transfère les sphéroïdes sur une diapositive et monte avec un lamelle.

Utilisez un microscope à fluorescence pour visualiser les cellules neuroendocrines du sphéroïde exprimant des protéines spécifiques.

Fixez les organoïdes en ajoutant 500 microlitres de paraformaldéhyde et en les incubant pendant 15 minutes. Après l’incubation, lavez la culture deux fois avec 1 millilitre de PBS. Ajouter 500 microlitres de PBS avec 3 % de BSA et 0,1 % de Triton X-100 pour perméabiliser la culture. Incuber le tube pendant cinq minutes, puis laver les organoïdes trois fois avec 1 millilitre de PBS et 3 % de BSA.

Ensuite, incubez la culture avec des anticorps primaires pendant une heure, puis répétez les lavages avec PBS et BSA. Incuber avec les anticorps secondaires et répéter les lavages, en veillant à aspirer et à jeter tout surnageant.

Pour imager les sphéroïdes, ajoutez 5 microlitres de support de montage contenant du DAPI, et utilisez une pipette P20 pour transférer 5 microlitres de sphéroïdes sur une lame de verre. Scellez la lame à l’aide d’une lamelle et imagez à l’aide d’un microscope à fluorescence à l’aide des objectifs 10, 20 et 40 fois.