Dosage de la phagocytose sur cellules vivantes de cellules de type microglie à l’aide de synaptosomes humains
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:28 min • April 28th, 2025
Prenez une plaque multi-puits contenant des cellules de type microglie présentant une activité phagocytaire.
Incuber avec une coloration nucléaire pour marquer les noyaux.
Ajouter un inhibiteur de polymérisation d’actine au puits de contrôle négatif.
Pendant l’incubation, l’inhibiteur se lie aux filaments d’actine, inhibant la polymérisation de l’actine et la phagocytose.
Maintenez la plaque à basse température et ajoutez des synaptosomes humains marqués à un colorant sensible au pH--des fragments isolés de terminaisons synaptiques neurales.
Centrifuge la plaque à basse température pour favoriser les interactions cellule-synaptosome mais prévenir l’absorption prématurée.
Transfère la plaque vers un système d’imagerie de cellules vivantes.
Dans le puits de test, les synaptosomes sont phagocytés et fusionnent avec les lysosomes pour former des phagolysosomes. L’environnement acide lysosomal active le colorant, ce qui entraîne sa fluorescence.
Au fil du temps, dans le puits de test, davantage de synaptosomes sont engloutis, ce qui entraîne une nouvelle augmentation de la fluorescence.
Cependant, dans le puits de contrôle négatif, la polymérisation de l’actine est inhibée, empêchant l’absorption des synaptoles. La fluorescence minimale résultante confirme la dépendance de la fluorescence à la phagocytose médiée par l’actine.
Le jour du test, prélever 40 microlitres de milieu par puits, et ajouter 10 microlitres de la solution de coloration nucléaire. Incuber l’assiette pendant deux heures. Décongelez les synaptosomes marqués sur de la glace et sonifiez doucement à l’aide d’un sonicateur d’eau pendant une minute. Encore une fois, placez immédiatement les synaptosomes sur de la glace. Diluez les synaptosomes marqués et le milieu complet IMG à 1 microlitre de synaptosomes pour 50 microlitres de milieu.
Pour un contrôle négatif, préparez 60 micromolaires de cytochalasine D dans un milieu complet IMG pour inhiber la polymérisation de l’actine, et donc la phagocytose. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de cette solution dans chaque puits pour une concentration finale de 10 micromolaires et incubez pendant 30 minutes. Retirez la plaque de l’incubateur et incubez à 10 degrés Celsius pendant 10 minutes. Maintenez la plaque sur de la glace et ajoutez 50 microlitres de milieu contenant des synaptosomes.
Centrifuge la plaque à 270 fois g pendant trois minutes à 10 degrés Celsius et maintiens la plaque sur la glace jusqu’à l’acquisition de l’imagerie. Insérez la plaque dans un lecteur d’imagerie de cellules vivantes et sélectionnez les puits à analyser. Ensuite, sélectionnez un objectif 20x. Ensuite, ajustez la mise au point, la diode électroluminescente ou l’intensité de la LED, le temps d’intégration et le gain du champ clair et des canaux bleus. La fluorescence des synaptosomes doit être négligeable au point temporel initial.
Sélectionnez le nombre de tuiles individuelles à acquérir dans un montage par puits. Acquérez 16 tuiles au centre du puits, en imageant environ 5 % de la surface totale du puits. Réglez la température sur 37 degrés Celsius et l’intervalle de temps souhaité pour l’imagerie.
Aperçu
Cette étude examine l'activité phagocytaire de cellules semblables aux microglies à l'aide d'un système d'imagerie de cellules vivantes. Les effets de l'inhibition de la polymérisation de l'actine sur l'absorption des synaptosomes sont analysés afin de comprendre les mécanismes de la phagocytose.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Immunologie
Contexte
- Les microglies sont des cellules immunitaires du cerveau qui jouent un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie.
- La phagocytose est une fonction clé des microglies, leur permettant d'éliminer les débris et les composants synaptiques.
- La polymérisation de l'actine est essentielle au processus de phagocytose dans de nombreux types cellulaires.
- Comprendre les mécanismes de la phagocytose peut fournir des informations sur les affections neuroinflammatoires.
Objectif de l'étude
- Évaluer le rôle de la polymérisation de l’actine dans la phagocytose des synaptosomes par des cellules de type microgliale.
- Utiliser l’imagerie de cellules vivantes pour visualiser la dynamique de l’internalisation des synaptosomes.
- Mettre en place une condition témoin qui inhibe la polymérisation de l’actine afin de permettre la comparaison.
Méthodes utilisées
- Des cellules de type microglial ont été cultivées dans des plaques multi-puits et traitées avec des colorants nucléaires.
- Un inhibiteur de la polymérisation de l'actine a été ajouté aux puits du témoin négatif.
- Des synaptosomes ont été marqués avec un colorant sensible au pH et incubés avec les cellules.
- Une imagerie en temps réel sur cellules vivantes a été réalisée pour suivre les variations de fluorescence indiquant une phagocytose.
Résultats principaux
- Dans les puits de test, une fluorescence accrue indiquait une phagocytose réussie des synaptosomes.
- Les puits de contrôle négatif montraient une fluorescence minimale en raison de l'inhibition de la polymérisation de l'actine.
- L'intensité de la fluorescence était corrélée au nombre de synaptosomes englobés au fil du temps.
- Les résultats ont confirmé la dépendance de la phagocytose vis-à-vis de la dynamique de l'actine.
Conclusions
- La polymérisation de l'actine est essentielle pour l'activité phagocytaire des cellules de type microgliales.
- L'imagerie en temps réel sur cellules vivantes est une méthode efficace pour étudier les interactions cellulaires et la dynamique cellulaire.
- Cette étude améliore la compréhension de la fonction microgliale dans le maintien synaptique et l'inflammation neurologique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Les tests quantitatifs de phagocytose en cellules vivantes utilisant des synaptosomes humains et des cellules de type microglial fournissent une plateforme robuste pour analyser les mécanismes neuro-immunitaires liés aux voies de maladies neurodégénératives. Cette approche permet une détection mécanistique des risques et une validation des cibles en isolant la fonction phagocytaire dépendante de l’actine dans un système pertinent pour l’humain. Le test offre une confiance prédictive pour les décisions précoces concernant les portefeuilles de recherche sur la neuroinflammation et le maintien synaptique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet la validation fonctionnelle des voies de phagocytose des microglies à l'aide de substrats d'origine humaine.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en isolant la polymérisation de l'actine comme variable critique dans l'élimination synaptique.
- Permet une interrogation fondée sur des hypothèses ciblant les acteurs neuro-immunitaires impliqués dans la progression des maladies.
Développement de tests et criblage
- Offre une lecture reproductible et quantitative de l'activité phagocytaire par fluorescence sensible au pH.
- Normalise les contrôles négatifs à l'aide d'inhibiteurs de la polymérisation de l'actine pour assurer la spécificité du test.
- Prépare des systèmes cellulaires de type microglie validés pour des études de criblage de composés ou d'analyses de perturbations génétiques en aval.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les paramètres de phagocytose in vitro avec les mécanismes de suppression synaptique pertinents pour la maladie.
- Permet une continuité entre la découverte et la validation préclinique dans les modèles d'inflammation neurologique et de dégénérescence neuronale.
- Facilite l'avancement pondéré des risques des cibles neuro-immunitaires selon des preuves fonctionnelles.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce test sur cellules vivantes s'inscrit dans le continuum de la découverte précoce à l'identification de candidats, fournissant des données exploitables pour la validation de cibles et des études mécanistiques en neurobiologie.
- Découverte en biologie : Quantifie la phagocytose dépendante de l’actine, précisant le rôle des voies impliquées dans l’élimination synaptique.
- Essais de criblage : Fournit des résultats normalisés et reproductibles basés sur la fluorescence, permettant des analyses comparatives.
- Analyse : Permet une mesure résolue dans le temps de l’internalisation des synaptosomes et des comparaisons statistiques entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Relie les résultats obtenus in vitro à des modèles précliniques d’inflammation neurologique lorsque les mécanismes de la maladie sont pris en compte.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme d’essai réutilisable pour divers programmes ciblant le système neuro-immunitaire.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles neuro-immunitaires et la réduction des risques mécanistiques.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation des tests au sein des équipes de découverte.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller/arrêt en fournissant des données fonctionnelles quantitatives et pertinentes pour l'humain.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des programmes de neuroinflammation et de maintien synaptique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie de cellules vivantes et en analyse quantitative de la fluorescence.
- Suppose l'accès à des préparations de synaptosomes humains et à des cultures validées de cellules de type microglial.
- Exige des contrôles négatifs standardisés pour assurer la spécificité et la reproductibilité du test.
- Pourrait nécessiter des adaptations selon les sources cellulaires ou les substrats synaptiques utilisés.
- Dépend de l'infrastructure d'imagerie et de pipelines d'analyse de données robustes.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026