Détection du cotransporteur neuronal phosphorylé de chlorure de potassium 2 par Western Blot

Prenez un lysat cellulaire contenant du cotransporteur 2 de chlorure de potassium, ou des protéines KCC2, qui régulent les niveaux de chlorure neuronal.

La phosphorylation aux sites régulateurs perturbe la fonction de KCC2, modulant l’activité neuronale.

Ajoutez le lysat aux billes conjuguées avec des anticorps ciblant KCC2 phosphorylé. Incuber pour permettre la liaison, puis laver pour éliminer les protéines non liées et les débris cellulaires.

Traiter avec un tampon dénaturant à haute température pour libérer KCC2, puis centrifuger pour séparer les billes.

Charge le surnageant contenant KCC2 sur un gel d’électrophorèse. Séparez les protéines en bandes pour confirmer la présence de KCC2 phosphorylé.

Transfère les bandes sur une membrane, puis incube dans une solution bloquante pour masquer les sites de liaison non spécifiques.

Incuber avec des anticorps primaires ciblant KCC2 phosphorylé.

Lavez, puis incubez avec des anticorps secondaires marqués par des enzymes pour marquer les anticorps primaires.

Lavez à nouveau, puis ajoutez un substrat chimiluminescent, qui réagit avec l’enzyme pour produire de la lumière.

Mesurer l’intensité lumineuse pour quantifier KCC2 phosphorylé dans le lysat.

Pipette 300 microlitres de protéine G sépharose dans un tube de microcentrifugation. Ensuite, centrifugez la solution à 500 G pendant deux minutes. Après avoir jeté le surnageant, ajoutez 500 microlitres de PBS et vortex bien. Jetez le surnageant après la centrifugation et répétez cette étape.

Ensuite, mélangez 1 milligramme d’anticorps anti-KCC2 thréonine 906 et anti-KCC2 thréonine 1007 avec 200 microlitres de billes de sépharose de protéine G, avant de porter le volume à 500 microlitres avec du PBS. Après avoir secoué sur une plate-forme vibrante ou une roue tournante pendant deux heures à 4 degrés Celsius, répétez deux lavages avec du PBS.

Effectue une quantification des protéines sur les lysats cellulaires, et ajoute 1 milligramme de lysat cellulaire aux billes lavées et incube dans un rotateur de bout en bout avant de tourner. Effectuez trois lavages avec du PBS contenant 150 millimolaires de chlorure de sodium, suivis de trois lavages avec 200 microlitres de PBS avant de remettre en suspension la pastille finale dans 100 microlitres de tampon d’échantillon LDS.

Secouez les tubes dans un agitateur à rotor à température ambiante pendant cinq minutes. Incuber-les dans un bloc chauffant et les centrifuger avant d’utiliser le surnageant pour le chargement du gel. Assemblez l’appareil de coulée Western Blot et versez du gel séparateur à 8 % fraîchement préparé pour couler le gel, en laissant environ 2 centimètres d’espace à partir du haut du verre de coulée. Ajoutez 200 microlitres d’isopropanol absolu à l’installation et laissez-le reposer à température ambiante pendant 60 minutes.

Retirez l’isopropanol à l’aide d’une pipette et rincez soigneusement le gel avec environ 200 microlitres d’eau distillée. Après avoir ajouté du gel d’empilage à 6 % fraîchement préparé à la configuration de coulée, insérez délicatement le peigne de puits et laissez reposer à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, fixez le gel coulé dans le réservoir d’électrophorèse.

Après avoir versé le tampon de coulée dans le réservoir, chargez 5 microlitres de marqueur de poids moléculaire dans le premier puits, et une quantité égale de protéines dans chaque puits du gel SDS-PAGE. Remplissez les puits vides avec LDS et faites fonctionner le gel pendant environ 90 à 120 minutes à 120 volts. Réhydrater la membrane de nitrocellulose avec un tampon de transfert contenant 20 % de méthanol.

Rincez le gel et la membrane avec le tampon de transfert, et étalez-les doucement sur la pile de préparation. Disposez le sandwich à transférer dans cet ordre, électrode négative, mousse sandwich, papier filtre, gel SDS-PAGE rincé, membrane nitrocellulosique rincée, papier filtre, mousse sandwich, électrode positive. Une fois cela fait, empilez le sandwich assemblé dans le réservoir de transfert et faites-le fonctionner à 90 volts pendant 90 minutes, ou à 30 volts pendant 360 minutes.

Bloque la membrane sèche pendant 1 heure à température ambiante à l’aide d’un tampon de blocage. Incuber les membranes avec des dilutions appropriées d’anticorps primaires et de bêta-actine dans un tampon de blocage pendant 1 heure à température ambiante ou toute la nuit à 4 degrés Celsius. Ensuite, donnez trois lavages de TBST pendant 5 minutes chacun.

Incuber la membrane lavée avec un anticorps secondaire dilué dans un tampon bloquant pendant 60 minutes, et répéter trois lavages de TBST. Une fois cela fait, placez la membrane lavée sur la carte d’imagerie. Pour développer les signaux, étalez la solution préparée en mélangeant des volumes égaux de chaque réactif de chimiluminescence améliorée sur la membrane, avant de transférer la carte d’imagerie au système d’imagerie pour l’imagerie.