Détection du cotransporteur neuronal phosphorylé de chlorure de potassium 2 par Western Blot

Prenez un lysat cellulaire contenant du cotransporteur 2 de chlorure de potassium, ou des protéines KCC2, qui régulent les niveaux de chlorure neuronal.

La phosphorylation aux sites régulateurs perturbe la fonction de KCC2, modulant l’activité neuronale.

Ajoutez le lysat aux billes conjuguées avec des anticorps ciblant KCC2 phosphorylé. Incuber pour permettre la liaison, puis laver pour éliminer les protéines non liées et les débris cellulaires.

Traiter avec un tampon dénaturant à haute température pour libérer KCC2, puis centrifuger pour séparer les billes.

Charge le surnageant contenant KCC2 sur un gel d’électrophorèse. Séparez les protéines en bandes pour confirmer la présence de KCC2 phosphorylé.

Transfère les bandes sur une membrane, puis incube dans une solution bloquante pour masquer les sites de liaison non spécifiques.

Incuber avec des anticorps primaires ciblant KCC2 phosphorylé.

Lavez, puis incubez avec des anticorps secondaires marqués par des enzymes pour marquer les anticorps primaires.

Lavez à nouveau, puis ajoutez un substrat chimiluminescent, qui réagit avec l’enzyme pour produire de la lumière.

Mesurer l’intensité lumineuse pour quantifier KCC2 phosphorylé dans le lysat.