JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 2:38 min • April 28th, 2025
Fixez un tube endothélial artériolaire prélevé sur le cerveau d’une souris dans une chambre avec un flux tampon continu.
Placez la chambre dans une configuration d’enregistrement.
Introduisez un colorant fluorescent sensible au calcium. Incuber pour permettre l’absorption cellulaire du colorant.
Lavez pour enlever tout colorant non intériorisé.
Insérez une électrode dans une cellule endothéliale et enregistrez le potentiel de la membrane au repos.
Augmentez la température du bain à une température physiologique pour faciliter la liaison du calcium intracellulaire au colorant.
Excitez le colorant et mesurez la fluorescence pour quantifier les niveaux de calcium cellulaire de base. Introduisez
un médicament qui se lie à des récepteurs spécifiques couplés aux protéines G sur les cellules endothéliales, initiant une cascade de signalisation.
Cette cascade libère des ions calcium du réticulum endoplasmique dans le cytoplasme, améliorant ainsi la liaison et la fluorescence du colorant calcique.
Des niveaux élevés de calcium cytoplasmique activent également les canaux potassiques, facilitant l’efflux d’ions potassique et diminuant le potentiel membranaire.
Enregistrez les données.
Une fluorescence accrue et une diminution du potentiel membranaire indiquent un tube endothélial fonctionnel.
Pour mesurer le potentiel de la membrane endothéliale, tout en regardant à travers l’objectif quatre fois, positionnez soigneusement la pointe de l’électrode pointue juste au-dessus d’une cellule du tube endothélial artériel dans la solution saline physiologique qui s’écoule à l’aide d’un micromanipulateur. Progressivement, augmentez le grossissement jusqu’à 400 fois et repositionnez la pointe de l’électrode si nécessaire. À l’aide du micromanipulateur, insérez doucement la pointe d’une électrode pointue dans l’une des cellules du tube endothélial et commencez à enregistrer la VM à l’aide d’un électromètre.
Une fois que la VM endothéliale au repos est stable de moins 30 à moins 40 millivolts, appliquez les agents pharmacologiques souhaités par objectif expérimental. Chargez le tube endothélial avec le traqueur de fluorescence pour la membrane plasmique ou l’organite souhaité à 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes. Lavez les cellules avec une solution saline physiologique de superfusion fraîche et imagez les cellules vivantes au microscope à la longueur d’onde d’excitation des colorants respectifs.