Immunoprécipitation de la chromatine native des cellules de la neurosphère

Prenez des cellules de la neurosphère dans un tampon contenant des détergents, du calcium et des inhibiteurs de protéase.

Le détergent perméabilise les cellules, tandis que l’inhibiteur inactive les protéases pour préserver la protéine cible liée à la chromatine.

Ajouter la nucléase et incuber. La nucléase utilise le calcium pour digérer la chromatine.

Ajoutez un tampon contenant de l’EDTA qui chélate le calcium, inactivant la nucléase.

Ajoutez un tampon de lyse pour lyser les cellules, libérant ainsi la chromatine.

Centrifugez et récupérez le surnageant.

Ajouter des anticorps spécifiques à la protéine cible et incuber en rotation. Centrifugez et retirez le surnageant.

Introduisez des billes magnétiques ciblant l’anticorps et incubez avec rotation.

Ajoutez un tampon de lyse pour séparer l’ADN non spécifiquement lié.

Capturez magnétiquement les billes et retirez le surnageant.

Ajoutez un tampon riche en sel pour séparer les protéines non spécifiquement liées.

Capturez magnétiquement les billes et retirez le surnageant.

Ajoutez un tampon de stabilisation, capturez magnétiquement les billes et éliminez les contaminants.

Remise en suspension dans un tampon protéinase-K pour digérer les protéines, libérant ainsi l’ADN.

Une fois les neurosphères récoltées, centrifugez 1 fois 10 aux 6 cellules de la neurosphère par immunoprécipitation à 300 fois g pendant 5 minutes. Après la centrifugation, décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille de neurosphère dans un millilitre de solution saline équilibrée. Transférez la suspension dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre à faible liaison protéique, puis centrifugez comme précédemment.

Ensuite, décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 95 microlitres de tampon de digestion complété 1 à 100 par un cocktail d’inhibiteur de protéase par 1 fois 10 à 6 cellules. Pipetez immédiatement les cellules de haut en bas pour éviter qu’elles ne s’agglutinent et ne créent pas de bulles. Mélangez ensuite 5 microlitres de nucléase micrococcique 0,1x et 145 microlitres de tampon de digestion, et ajoutez 5 microlitres de nucléase micrococcique diluée par 1 fois 10 aux 6 cellules. Agitez le tube pour mélanger et placez le tube dans un bloc de chaleur à 37 degrés Celsius pendant exactement 12 minutes.

La digestion des nucléases micrococciques pour fragmenter la chromatine est l’étape la plus critique. Une bonne fragmentation de la chromatine est importante pour obtenir une résolution élevée pour la ChIP. Pour vous assurer que cette étape est couronnée de succès, incubez plusieurs échantillons un à la fois pour éviter une digestion excessive.

Après 12 minutes, ajoutez 10 microlitres de 10x tampon d’arrêt de nucléase micrococcique par 1 fois 10 aux 6 cellules. À partir de ce moment, les échantillons doivent être conservés sur de la glace. L’analyse par bio-analyseur de l’échantillon de nucléases micrococciques digéré démontre que la majeure partie de l’ADN a été fragmentée en mono, di et trinucléosomes. Ensuite, ajoutez 110 microlitres de 2x tampon RIPA complété 1 à 100 avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase pour 1 fois 10 aux 6 cellules.

Agitez le tube pour mélanger puis centrifugez pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius et 1 700 fois g. Transférez le surnageant qui contient la chromatine dans un tube de microcentrifugation ordinaire de 1,5 millilitre et placez-le sur de la glace. Utilisez un tampon RIPA complété par des inhibiteurs de protéase à 1 à 1 000 pour diluer la chromatine de sorte que chaque IP ait un volume de 100 à 200 microlitres. Prélever ensuite une aliquote équivalente à 10 % du volume ChIP comme échantillon d’entrée.

Préparez l’entrée en ajoutant 100 microlitres de tampon TE complété par la protéinase-K et incubez à 55 degrés Celsius pendant une heure. Après avoir purifié l’entrée avec un kit de purification PCR, mesurez la concentration de l’entrée à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume. Enregistrez les résultats dans un carnet. Ajouter 10 microlitres de billes magnétiques de protéines A et G lavées par IP qui seront effectuées sur chaque échantillon et incuber pendant une heure à 4 degrés Celsius avec rotation à 20 tr/min.

Placez l’échantillon sur un support magnétique et laissez les billes se séparer. Transférez ensuite le volume requis dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre. Ajoutez l’anticorps souhaité dans chaque tube, puis enveloppez les capuchons d’un film de paraffine plastique pour éviter l’évaporation. Incuber les échantillons pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec rotation comme précédemment. Le lendemain, faites tourner les tubes à 2000 fois g pendant 10 secondes. Ajoutez ensuite 10 microlitres de billes à chaque IP et incubez pendant trois heures à 4 degrés Celsius avec rotation à 20 tr/min.

Ensuite, placez les échantillons sur un support magnétique et laissez les billes magnétiques se séparer. À l’aide d’une pipette, retirez le surnageant. Ajoutez ensuite 150 microlitres de tampon RIPA avec inhibiteurs de protéase à chaque IP et incubez à 4 degrés Celsius à 20 tr/min pendant 5 minutes. Après la période d’incubation, placez les échantillons sur un support magnétique et laissez les billes magnétiques se séparer. À l’aide d’une pipette, retirez le surnageant. Ajoutez ensuite 150 microlitres de tampon de chlorure de lithium complété par des inhibiteurs de protéase à faible concentration à chaque IP et incubez à 4 degrés Celsius avec rotation à 20 tr/min pendant 5 minutes.

Après la période d’incubation, placez les échantillons sur un support magnétique et laissez les billes magnétiques se séparer. Ensuite, utilisez une pipette pour retirer le surnageant. Ajoutez ensuite 150 microlitres de TE froid sans inhibiteurs de protéase aux billes et incubez à 4 degrés Celsius avec rotation à 20 tr/min pendant 5 minutes. Après l’étape finale de lavage, remettre l’échantillon en suspension dans 100 microlitres de tampon TE complété par la concentration finale de 0,5 milligramme par millilitre de protéinase-K et incuber à 55 degrés Celsius pendant une heure.