Réalisation d’une hybridation in situ à double fluorescence pour détecter l’expression génique dans des sections de cerveau de souris
Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 4:06 min • April 28th, 2025
Prenez une section de cerveau de souris fixée chimiquement.
Ajouter un mélange d’hybridation contenant un agent de perméabilisation et des sondes d’ARN marquées au FITC ou au DIG.
Incuber pour permettre la perméabilisation des cellules et l’entrée de la sonde.
Les sondes se lient à des séquences complémentaires sur l’ARNm MBP, un marqueur de référence exprimé ubiquitement dans les oligodendrocytes, ou l’ARNm ASPA, la cible.
Laver pour enlever les sondes non liées.
Ajoutez un tampon de blocage pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.
Introduire des anticorps anti-FITC conjugués à la HRP ciblant la sonde marquée au FITC.
Lavez, puis ajoutez le FITC-tyramide.
HRP oxyde le FITC-tyramide en une forme hautement réactive qui se lie aux protéines voisines, amplifiant ainsi le signal de fluorescence.
Lavez et réintroduisez le tampon de blocage.
Ajoutez des anticorps anti-DIG conjugués à la phosphatase alcaline ciblant la sonde marquée DIG.
Lavez et appliquez la solution Fast Red.
La phosphatase alcaline déphosphoryle Fast Red, produisant un précipité fluorescent.
Visualisez sous un microscope à fluorescence.
La co-localisation des signaux Mbp et ASPA indique l’expression d’ASPA dans les olig
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