Réalisation d’une hybridation in situ à double fluorescence pour détecter l’expression génique dans des sections de cerveau de souris
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 4:06 min • April 28th, 2025
Prenez une section de cerveau de souris fixée chimiquement.
Ajouter un mélange d’hybridation contenant un agent de perméabilisation et des sondes d’ARN marquées au FITC ou au DIG.
Incuber pour permettre la perméabilisation des cellules et l’entrée de la sonde.
Les sondes se lient à des séquences complémentaires sur l’ARNm MBP, un marqueur de référence exprimé ubiquitement dans les oligodendrocytes, ou l’ARNm ASPA, la cible.
Laver pour enlever les sondes non liées.
Ajoutez un tampon de blocage pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.
Introduire des anticorps anti-FITC conjugués à la HRP ciblant la sonde marquée au FITC.
Lavez, puis ajoutez le FITC-tyramide.
HRP oxyde le FITC-tyramide en une forme hautement réactive qui se lie aux protéines voisines, amplifiant ainsi le signal de fluorescence.
Lavez et réintroduisez le tampon de blocage.
Ajoutez des anticorps anti-DIG conjugués à la phosphatase alcaline ciblant la sonde marquée DIG.
Lavez et appliquez la solution Fast Red.
La phosphatase alcaline déphosphoryle Fast Red, produisant un précipité fluorescent.
Visualisez sous un microscope à fluorescence.
La co-localisation des signaux Mbp et ASPA indique l’expression d’ASPA dans les oligodendrocytes.
Diluez les deux sondes dans un tampon d’hybridation, préchauffé à 65 degrés Celsius, et mélangez bien. Appliquez 300 microlitres de mélange d’hybridation sur chaque lame et recouvrez d’une lamelle cuite au four. Par la suite, incubez les lames pendant la nuit à 65 degrés Celsius dans une chambre humidifiée.
Le lendemain, transférez les lames dans un bocal Coplin contenant un tampon de lavage préchauffé et lavez les lames pendant 30 minutes, deux fois à 65 degrés Celsius. Après cela, lavez les lames pendant 10 minutes trois fois avec la solution de lavage MABT à température ambiante.
Dans cette étape, utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner des cercles autour des sections de tissus. Ensuite, incubez les lames pendant une heure à température ambiante avec un tampon bloquant ISH dans une chambre humidifiée. Ensuite, incubez les lames pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec un anticorps anti-FITC conjugué à la peroxydase de raifort.
Ensuite, placez les lames dans un bocal Coplin contenant du PBST. Lavez-les trois fois au PBST pendant 10 minutes à chaque fois, et remplacez-les par du PBST frais à chaque fois. Ensuite, ajoutez du tyramide fluorescent aux lames et laissez-les pendant 10 minutes à température ambiante. Placez les lames dans un bocal Coplin et lavez-les au PBST pendant 10 minutes trois fois.
Par la suite, incubez les lames avec un tampon de blocage ISH pendant une heure à température ambiante. Ensuite, incubez les lames pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec un anticorps anti-DIG conjugué à la phosphatase alcaline. Après cela, lavez-les avec MABT trois fois pendant 10 minutes à chaque fois. Ensuite, lavez les lames deux fois avec 0,1 molaire de Tris-HCL à pH 8,2 pendant cinq minutes à température ambiante.
Filtrez la solution rouge rapide et incubez les lames à 37 degrés Celsius avec une solution rouge rapide dans une chambre humidifiée. Comme le temps de développement optimal varie, vérifiez régulièrement les lames avec un microscope fluorescent pour surveiller la formation de précipité. Ensuite, lavez-les trois fois avec du PBST pendant 10 minutes à chaque fois.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant de détecter l'expression des ARNm dans les oligodendrocytes à l'aide de la microscopie de fluorescence. La technique repose sur l'hybridation de sondes ARN avec des cibles spécifiques d'ARNm, suivie d'une amplification du signal et de sa visualisation.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Biologie moléculaire
Contexte
- Les oligodendrocytes jouent un rôle crucial dans le système nerveux central.
- La compréhension de l'expression des ARNm dans ces cellules peut fournir des informations sur les affections neurologiques.
- La microscopie à fluorescence permet la visualisation de cibles spécifiques d'ARNm.
- Les techniques d'hybridation sont essentielles pour l'étude de l'expression génique.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour détecter l'ARNm ASPA dans les oligodendrocytes.
- Améliorer la visualisation de l'ARNm par amplification du signal.
- Démontrer la co-localisation des signaux MBP et ASPA.
Méthodes utilisées
- Préparation de coupes de cerveau de souris fixées chimiquement.
- Application du mélange d'hybridation contenant les sondes d'ARN.
- Utilisation de tampons bloquants pour prévenir la liaison non spécifique.
- Microscopie à fluorescence pour la visualisation de l'expression des ARNm.
Résultats principaux
- Liaison réussie des sondes aux séquences d'ARNm cibles.
- Amplification des signaux de fluorescence par des réactions enzymatiques.
- La co-localisation des signaux MBP et ASPA a confirmé l'expression d'ASPA.
- La méthode a démontré sa fiabilité pour l'étude des ARNm dans les oligodendrocytes.
Conclusions
- La méthode développée est efficace pour la détection d'ARNm spécifiques dans les tissus cérébraux.
- L'amplification du signal fluorescent améliore les capacités de visualisation.
- Cette technique peut être appliquée à des études ultérieures sur la fonction des oligodendrocytes.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'hybridation in situ en fluorescence double (FISH) permet une cartographie spatiale précise de l'expression génique dans des sections de cerveau de souris, soutenant la découverte précoce et la validation de cibles en recherche et développement axés sur la neurobiologie. La capacité de cette méthode à détecter simultanément deux cibles ARN avec une haute sensibilité offre une clarté mécanistique et une confiance prédictive pour l'analyse des voies biologiques et l'expression spécifique aux types cellulaires. Cette capacité est essentielle pour réduire les risques associés aux cibles et guider les décisions stratégiques dans la découverte de médicaments du système nerveux central.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une visualisation directe de la co-expression génique dans des populations cellulaires neuronales définies.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en confirmant la présence d'ARN cibles dans des types cellulaires pertinents pour la maladie.
- Permet une validation fonctionnelle des cibles grâce à une analyse d'expression spatialement résolue.
- Offre une confiance prédictive pour la progression des cibles vers des voies de criblage.
Développement de criblages et de tests
- Établit des tests basés sur les tissus validés pour l'évaluation de composés en aval.
- Fournit des mesures quantitatives et reproductibles de fluorescence pour la standardisation des tests.
- Permet une analyse robuste de la co-localisation afin d'appuyer des stratégies de criblage multiplexés.
- Prépare les systèmes biologiques pour des flux de travail d'imagerie à haut contenu et évolutifs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les données d'expression génique avec les circuits neuronaux et les types cellulaires pertinents pour la maladie.
- Facilite l'identification de biomarqueurs translationnels grâce à la transcriptomique spatiale.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en reliant les découvertes moléculaires au contexte tissulaire.
- Réduit le risque de translation en confirmant l'engagement de la cible dans les régions cérébrales pertinentes.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole FISH double s'intègre dans la continuité découverte-préclinique en permettant la validation fondée sur des hypothèses de l'expression génique in situ, contribuant ainsi à la sélection des cibles et aux stratégies de biomarqueurs.
- Biologie de la découverte : Confirme l'expression spatiale et spécifique aux types cellulaires des cibles candidates dans le tissu cérébral.
- Écranage : Fournit des données quantitatives et reproductibles de fluorescence pour le développement et l'optimisation des tests.
- Analytique : Fournit des mesures de co-localisation et d'intensité afin de comparer l'expression génique dans différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la découverte moléculaire et la validation au niveau tissulaire pour l'alignement des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme standardisée et adaptable pour l'analyse multiplexée de l'expression génique dans divers programmes du SNC.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Fournit des tests standardisés, reproductibles et évolutifs basés sur les tissus.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon et l'affectation des capitaux en clarifiant précocement la biologie des cibles.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et un développement ajustés au risque des cibles et biomarqueurs du système nerveux central.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation des tissus, conception de sondes et microscopie à fluorescence.
- Exige un accès à une infrastructure d'imagerie de haute qualité et à des outils d'analyse quantitative.
- Implique une standardisation entre équipes des protocoles d'étiquetage des sondes et de détection.
- Peut nécessiter des adaptations selon les types de tissus ou les cibles d'ARN.
- Les étapes d'amplification du signal doivent être optimisées afin de concilier sensibilité et spécificité.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026