Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 4:06 min • April 28th, 2025
Prenez une section de cerveau de souris fixée chimiquement.
Ajouter un mélange d’hybridation contenant un agent de perméabilisation et des sondes d’ARN marquées au FITC ou au DIG.
Incuber pour permettre la perméabilisation des cellules et l’entrée de la sonde.
Les sondes se lient à des séquences complémentaires sur l’ARNm MBP, un marqueur de référence exprimé ubiquitement dans les oligodendrocytes, ou l’ARNm ASPA, la cible.
Laver pour enlever les sondes non liées.
Ajoutez un tampon de blocage pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.
Introduire des anticorps anti-FITC conjugués à la HRP ciblant la sonde marquée au FITC.
Lavez, puis ajoutez le FITC-tyramide.
HRP oxyde le FITC-tyramide en une forme hautement réactive qui se lie aux protéines voisines, amplifiant ainsi le signal de fluorescence.
Lavez et réintroduisez le tampon de blocage.
Ajoutez des anticorps anti-DIG conjugués à la phosphatase alcaline ciblant la sonde marquée DIG.
Lavez et appliquez la solution Fast Red.
La phosphatase alcaline déphosphoryle Fast Red, produisant un précipité fluorescent.
Visualisez sous un microscope à fluorescence.
La co-localisation des signaux Mbp et ASPA indique l’expression d’ASPA dans les oligodendrocytes.
Diluez les deux sondes dans un tampon d’hybridation, préchauffé à 65 degrés Celsius, et mélangez bien. Appliquez 300 microlitres de mélange d’hybridation sur chaque lame et recouvrez d’une lamelle cuite au four. Par la suite, incubez les lames pendant la nuit à 65 degrés Celsius dans une chambre humidifiée.
Le lendemain, transférez les lames dans un bocal Coplin contenant un tampon de lavage préchauffé et lavez les lames pendant 30 minutes, deux fois à 65 degrés Celsius. Après cela, lavez les lames pendant 10 minutes trois fois avec la solution de lavage MABT à température ambiante.
Dans cette étape, utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner des cercles autour des sections de tissus. Ensuite, incubez les lames pendant une heure à température ambiante avec un tampon bloquant ISH dans une chambre humidifiée. Ensuite, incubez les lames pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec un anticorps anti-FITC conjugué à la peroxydase de raifort.
Ensuite, placez les lames dans un bocal Coplin contenant du PBST. Lavez-les trois fois au PBST pendant 10 minutes à chaque fois, et remplacez-les par du PBST frais à chaque fois. Ensuite, ajoutez du tyramide fluorescent aux lames et laissez-les pendant 10 minutes à température ambiante. Placez les lames dans un bocal Coplin et lavez-les au PBST pendant 10 minutes trois fois.
Par la suite, incubez les lames avec un tampon de blocage ISH pendant une heure à température ambiante. Ensuite, incubez les lames pendant la nuit à 4 degrés Celsius avec un anticorps anti-DIG conjugué à la phosphatase alcaline. Après cela, lavez-les avec MABT trois fois pendant 10 minutes à chaque fois. Ensuite, lavez les lames deux fois avec 0,1 molaire de Tris-HCL à pH 8,2 pendant cinq minutes à température ambiante.
Filtrez la solution rouge rapide et incubez les lames à 37 degrés Celsius avec une solution rouge rapide dans une chambre humidifiée. Comme le temps de développement optimal varie, vérifiez régulièrement les lames avec un microscope fluorescent pour surveiller la formation de précipité. Ensuite, lavez-les trois fois avec du PBST pendant 10 minutes à chaque fois.