Coloration par immunofluorescence d’un tissu fibrovasculaire malade dérivé d’un patient incorporé dans du gel
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 4:31 min • April 28th, 2025
Prenez du tissu fibrovasculaire malade dérivé d’un patient enrobé de gel de fibrine réhydraté, fixé et perméabilisé. Ce tissu contient des structures néovasculaires irrégulières avec des cellules endothéliales et des péricytes.
Traitez le tissu avec une solution bloquante pour éviter la liaison d’anticorps non spécifiques.
Incuber avec des anticorps primaires ciblant les protéines de surface sur les cellules endothéliales et les péricytes.
Rincer avec un tampon pour éliminer les anticorps non liés, puis incuber dans un tampon.
Après le lavage du tampon, incuber avec des anticorps secondaires conjugués à un colorant fluorescent pour se lier aux anticorps primaires.
Laver avec un tampon pour éliminer l’excès d’anticorps et incuber dans un tampon.
Après le lavage du tampon, ajoutez un colorant nucléaire pour colorer les noyaux des cellules. Rincer avec un tampon et de l’eau déminéralisée pour enlever le colorant non lié.
Transférez le tissu sur une lame de microscope.
Appliquez le support de montage et scellez-le à l’aide d’une lamelle contenant un support de montage à durcissement rapide.
Après le séchage à l’air, rangez la lame à basse température. Ensuite, imagez le tissu sous un microscope à épifluorescence pour visualiser la disposition spatiale des cellules endothéliales et des péricytes au sein des structures néovasculaires.
Inclinez la plaque sur un support et incubez les gouttelettes dans 500 microlitres de solution de blocage pendant deux heures à température ambiante. Préparez le mélange d’anticorps primaires selon le protocole de texte.
Ensuite, utilisez une spatule à bord arrondi pour transférer les gouttelettes dans une plaque à fond rond de 96 puits. Incuber les gouttelettes dans 30 microlitres de mélange d’anticorps primaires par gouttelette pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Le lendemain, transférez les gouttelettes dans une plaque de 12 puits contenant 2 millilitres de solution de lavage par puits. Rincez les gouttelettes avec trois lavages de 5 minutes. Ensuite, lavez les gouttelettes avec neuf lavages de 30 minutes.
Le lendemain, rincez les gouttelettes trois fois avec du PBS. Préparez le mélange d’anticorps secondaires conjugués au fluorophore approprié conformément au protocole de texte. Transférez les gouttelettes dans une plaque à fond rond de 96 puits, comme démontré précédemment. Et incubez la plaque avec 30 microlitres de mélange d’anticorps secondaires pendant quatre heures à température ambiante, à l’abri de la lumière.
Après 4 heures, transférez les gouttelettes dans une plaque à 12 puits contenant 2 millilitres de solution de lavage par puits. Tout d’abord, rincez les gouttelettes avec trois lavages de 5 minutes. Lavez ensuite les gouttelettes avec quatre lavages de 30 minutes.
Le lendemain, rincez les gouttelettes cinq fois avec une solution de lavage pendant 30 minutes et trois fois avec du PBS pendant 30 minutes. Le lendemain, transférez les gouttelettes dans une plaque à fond rond à 96 puits, comme démontré précédemment. Contre-colorez les gouttelettes avec une coloration nucléaire Hoechst pendant 30 minutes à température ambiante. Transférez les gouttelettes dans une plaque de 12 puits contenant 2 millilitres de PBS par puits. Et rincez trois fois avec du PBS.
Ensuite, appliquez une couche étroite de support de montage à durcissement rapide le long des bords d’un verre de couverture carré. Et laissez-le sécher pendant une minute. Ensuite, rincez une gouttelette en la trempant dans un puits d’une plaque à 12 puits contenant de l’eau déminéralisée. Et transférez la gouttelette sur une lame de microscope.
Ensuite, versez 15 microlitres de support de montage anti-décoloration non durcissant sur la gouttelette. Positionnez doucement le verre de protection sur la gouttelette avec le support de montage face à la diapositive. Et laissez les choses se calmer.
Laissez sécher les lames pendant deux heures à température ambiante et rangez-les à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Enfin, imagez les lames avec un microscope à épifluorescence droit équipé d’une fonction de sectionnement optique à l’objectif 20x ou 40x.
Aperçu
Cet article décrit un protocole d'imagerie de tissus fibrovasculaires pathologiques provenant de patients, en utilisant la microscopie fluorescente. La méthode implique l'utilisation d'anticorps spécifiques pour visualiser les cellules endothéliales et les péricytes au sein des structures néovasculaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Immunofluorescence
Contexte
- Le tissu fibrovasculaire joue un rôle crucial dans diverses maladies.
- Comprendre la composition cellulaire des structures néovasculaires est essentiel au développement de thérapies.
- La microscopie fluorescente permet une visualisation détaillée de l'architecture tissulaire.
- La coloration par anticorps est une technique clé pour identifier des types cellulaires spécifiques.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour l'imagerie des tissus fibrovasculaires pathologiques.
- Visualiser l'agencement spatial des cellules endothéliales et des péricytes.
- Approfondir la compréhension de la néovascularisation dans les contextes pathologiques.
Méthodes utilisées
- Préparation d'échantillons tissulaires inclus dans un gel de fibrine réhydraté.
- Blocage des liaisons non spécifiques des anticorps à l'aide d'une solution de blocage.
- Incertion avec les anticorps primaires et secondaires pour une coloration spécifique.
- Acquisition d'images à l'aide d'un microscope à épifluorescence.
Résultats principaux
- Visualisation réussie des cellules endothéliales et des péricytes dans les échantillons de tissu.
- Démonstration de l'efficacité du protocole de marquage par anticorps.
- Imagerie détaillée des structures néovasculaires obtenue.
- Le protocole fournit une base pour des études futures sur les tissus fibrovasculaires.
Conclusions
- Le protocole d'imagerie développé est efficace pour l'étude des tissus fibrovasculaires pathologiques.
- La microscopie fluorescente peut révéler des interactions cellulaires importantes.
- Cette méthode peut être appliquée à des recherches ultérieures en biologie vasculaire et dans les maladies associées.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole d'immunofluorescence permet une cartographie spatiale détaillée des cellules endothéliales et des péricytes dans un tissu fibrovasculaire dérivé de patients, facilitant ainsi la validation de cibles en recherche sur la rétinopathie diabétique proliférante. En préservant l'architecture néovasculaire au sein d'un gel de fibrine, cette méthode fournit un système pertinent sur le plan pathologique pour l'analyse mécanistique des voies angiogéniques. L'approche renforce la fiabilité prédictive de la sélection préclinique de cibles en reliant des marqueurs moléculaires à des anomalies structurelles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en visualisant l'expression protéique spécifique aux types cellulaires dans les tissus malades.
- Valeur opérationnelle : Soutient la réduction des risques biologiques grâce à l'observation directe des interactions entre cellules vasculaires dans un modèle d'origine humaine.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en corrélant la localisation des biomarqueurs avec les structures néovasculaires pathologiques.
Développement de tests et criblage
- Préparation du test : Prépare des systèmes biologiques validés pour des tests de composés en aval en stabilisant l'architecture tissulaire dans un gel.
- Résultat quantitatif : Génère des signaux basés sur la fluorescence permettant une comparaison standardisée de l'expression des protéines selon différentes conditions.
- Extensibilité : Permet des colorations multiplexées dans des formats de plaques de culture, augmentant le débit pour les campagnes de criblage d'anticorps.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Utilise un tissu fibrovasculaire dérivé de patients afin de préserver la fidélité physiopathologique dans les modèles précliniques.
- Continuité translationnelle : Relie les découvertes à la validation préclinique en maintenant le contexte tissulaire humain.
- Décisions adaptées au risque : Guide les critères de progression en révélant les effets hors cible sur les populations cellulaires vasculaires.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de l'identification de la cible à l'optimisation du composé précurseur, en fournissant une validation basée sur l'imagerie avant les tests fonctionnels.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en cartographiant l'expression protéique dans des types cellulaires spécifiques au sein de lésions néovasculaires.
- Écrantage : Permet la préparation d'essais grâce à une préparation reproductible des tissus et à des protocoles normalisés de coloration.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de fluorescence permettant la comparaison de l'engagement ciblé entre différents groupes expérimentaux.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité entre les observations réalisées sur des tissus humains et les études mécanistiques menées dans des systèmes modèles.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme d'imagerie réutilisable pour des projets de biologie vasculaire dans divers domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des modèles de maladies vasculaires.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à des procédures standardisées de blocage, de lavage et de montage.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en permettant une visualisation directe de l'interaction avec la cible dans les tissus pathologiques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en reliant les données moléculaires à la pathologie structurelle dans des échantillons d'origine humaine.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques d'immunofluorescence et en microscopie confocale/épifluorescence.
- Dépend de la validation des anticorps et des infrastructures de détection de la fluorescence.
- Exige une standardisation entre les équipes pour des protocoles de manipulation et de coloration des tissus cohérents.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application à différents types de tissus ou modèles de maladies.
- Limité par la disponibilité des tissus et la durée de viabilité en conditions de culture ex vivo.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026