Essai de calcium à base de cellules pour les moyennes et criblage à haut débit fonctions de canaux TRP utilisant Flexstation 3

L'objectif général de cette procédure est de démontrer l'utilisation du Flex Station trois pour étudier le profil pharmacologique du canal du récepteur potentiel transitoire, ou TRPA1. Cela est réalisé en préparant d'abord des cellules exprimant des canaux TRPA1 dans des plaques de microtitration à 96 puits.

Après lavage des cellules à l’aide d’un laveur de microplaque, les cellules sont chargées avec le colorant fluorescent sensible au calcium. Flu oh 4:00 AM Une période de chargement cellulaire est ensuite suivie par plusieurs lavages supplémentaires. L’étape suivante de la procédure consiste à préparer la plaque de composés, incluant un agoniste trip, a one et un antagoniste putatif trip, a one.

En dernière étape, les paramètres du logiciel sont configurés pour la lecture de la plaque sur le système Flex Station trois. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant des relations dose-réponse concernant l'activation de trip A un par l'acide flu phonémique, ainsi que son inhibition par le composé antagoniste A. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur les mécanismes d'activation de 21 en mesurant l'influx de calcium, elle peut également être appliquée à l'étude des fonctions d'autres canaux ioniques perméables au calcium et de récepteurs couplés aux protéines G, en utilisant des colorants sensibles au calcium comme les colorants frozen ou les colorants de potentiel maly.

L'avantage principal de cette méthode par rapport aux techniques existantes telles que l'imagerie calcique et le cartographiage manuel par patch est qu'elle permet un criblage à haut débit de la fonction et de la modulation des formules calciques, des canaux ferriques et d'autres récepteurs mobilisateurs de Ca, tout en économisant du temps. Avant le début de ce protocole, cultiver des cellules HEC 293 stablement transfectées avec la trip A1 jusqu'à une densité de 70 à 90 %, comme décrit dans le protocole écrit. Pour commencer la préparation des cellules destinées au test calcique, recouvrir des plaques 96 puits en pipetant 50 microlitres de poly-L-ornithine dans chaque puits, puis incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes.

Après l'incubation, rincer les cellules une fois avec le tampon phosphate salin de KO. Après la trypsine, transférer la quantité souhaitée de cellules HEC 2 93 dans un tube conique stérile de 15 millilitres et centrifuger l'échantillon. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire obtenu.

Dans le milieu de culture DMEM supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, distribuer 100 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque 96 puits. À l’aide d’une pipette multipuits, laisser la plaque reposer dans la hotte pendant au moins 30 minutes avant de la placer dans l’incubateur de culture cellulaire humidifié pendant 20 à 44 heures. Pour la préparation du dosage du calcium, préparer d’abord les solutions comme décrit dans le protocole écrit.

Une fois préparé, mélanger 10 microlitres d'une solution de fluoh 4:00 AM à une millimolaire avec 10 microlitres d'onic. F1 27, puis transférer la totalité du contenu dans 5 millilitres de tampon de dosage flu. Oh quatre supplémenté avec 0,1 % d'albumine de sérum bovin.

Ensuite, lavez les cellules cultivées dans des plaques 96 puits avec du HBSS à 80 microlitres par puits, deux fois, à l’aide d’un laveur de microplaque. Après le lavage, ajoutez la solution de chargement fluo-4 AM à 50 microlitres par puits à l’aide d’une pipette multicanal et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant cette période de chargement cellulaire d’une heure, préparez une série de solutions trois fois concentrées d’agonistes, une série de solutions trois fois concentrées d’antagonistes, et un grand volume d’agoniste à 300 micromolaire dans le tampon de dosage fluo-4.

300 microlitres des solutions de composés diluées dans une plaque de 96 puits pour composés. Organisez de manière à ce que la dilution sérielle d'un composé ainsi que les contrôles positif et négatif correspondants se trouvent dans la même colonne de la plaque de composés, chaque fois que possible. Étant donné que le Flex Station trois lit une colonne unique à la fois, pipetez 300 microlitres de la solution d'agoniste à 300 micromoles par litre à côté de chaque puit contenant l'antagoniste, comme étape finale de préparation cellulaire.

Lavez les cellules chargées trois fois avec le tampon acide flu oh quatre en utilisant le laveur de microplaque après le dernier lavage. Laissez 80 microlitres de tampon acide flu oh quatre dans chaque puits. Pour commencer la lecture de la plaque, allumez le système Flex Station trois et lancez le logiciel Soft Max Pro 5.2.

Enregistrez l'expérience avec un nouveau nom de fichier lors de la configuration. Choisissez le mode flex et saisissez les paramètres permettant de mesurer l'effet agoniste et antagoniste, tels qu'indiqués dans le protocole écrit. Ensuite, placez une nouvelle boîte de pointes, la plaque de composés et la plaque de lecture dans les plateaux appropriés de la station flex.Three.

Commencez la lecture de la plaque en cliquant sur le bouton de lecture dans le logiciel Soft Max Pro. Le Flex Station trois lira une colonne à la fois et ajoutera les composés aux points temporels préprogrammés sans interrompre la lecture. Une fois l'analyse terminée, les données expérimentales peuvent être traitées directement à l'aide du logiciel Soft Max PRO ou copiées et collées dans n'importe quel tableur tel que Microsoft Excel.

Pour analyser les données, générez des courbes de réponse en fonction de la concentration pour l'agoniste trip a one, l'acide flu phonémique, et pour le composé putatif antagoniste de trip a one, le composé A, en utilisant un ajustement aux moindres carrés comme décrit dans la procédure écrite trip. Trip a one est un canal cationique perméable au calcium dont l'activation provoque une entrée de calcium pouvant être détectée par le colorant sensible au calcium flu oh 4:00 AM. Des tracés représentatifs des cinétiques des variations de fluorescence en réponse à une série de concentrations d'acide flu phonémique ou de FFA sont présentés à des concentrations plus élevées. La FFA induit des augmentations de fluorescence avec une cinétique beaucoup plus rapide qu'à des concentrations plus faibles, malgré des niveaux de fluorescence maximale similaires.

Pour distinguer ces différences, la relation concentration-réponse a été établie en mesurant les vitesses initiales de l'augmentation de la fluorescence. Après l'ajout de concentrations variables de FFA, la concentration efficace maximale demi (CE50) du FFA a été déterminée à 55,4 micromolaire. La relation concentration-réponse d'inhibition de la réponse calcique induite par le FFA par un composé antagoniste putatif du récepteur TRPA1, le composé A, est également présentée.

Une dose a réduit indépendamment la réponse des cellules trip A one aux acides gras libres avec une concentration inhibitrice maximale à moitié de 4,3 micromolaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier les profils pharmacologiques des canaux triple A one et apparentés en utilisant la plateforme flag station three.