Name: Essai de calcium à base de cellules pour les moyennes et criblage à haut débit fonctions de canaux TRP utilisant Flexstation 3 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Découvrez le profilage pharmacologique des canaux TRPA1 humains par essai de calcium à haut débit avec le FlexStation 3. Cette méthode permet d'étudier la modulation des canaux ioniques calciques.

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Nous remercions les Drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris et Olga Chumakova pour leur soutien. Le système est Flexstation 3 cadre de la Facilité d&#39;imagerie Cytodynamic UTHSC. Nous remercions également les docteurs. Ardem Patapoutian et Michael Bandell du Scripps Research Institute et l&#39;Institut de génomique de la Fondation Novartis pour la recherche (GNF) pour fournir la lignée cellulaire HEK293-hTRPA1 stable. La recherche est financée en partie par des subventions du NIH (GM081658 à MXZ) et le Texas Medical Center Digestive Diseases Center (à HH) et la Mission Connect / TIRR Fondation (à HH).

1. Les préparations de cellules dans des plaques 96 puits Pour les cellules HEK293 transitoirement trasfected avec TRPA1 ADNc humain <ol><li> HEK293 cellules sont cultivées pendant un à deux jours dans Dulbecco Minimal Essential Medium (DMEM) contenant 4,5 mg / ml de glucose (Thermo Scientific, SH3002201), complétée par inactivé à la chaleur 10% de sérum de veau fœtal (Invitrogen, 16000-044), 50 unités / ml de pénicilline et 50 pg / ml de streptomycine (Invitrogen, 15140-163). Le jour de la transfection, la densité cellulaire devrait atteindre 70-90%. </li><li> Manteau plaques à 96 puits par pipetage 50 ul de poly-L-ornithine (Sigma P3655, 20 pg / ml en eau distillée stérile) dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant au moins 15 min. Rincez chaque puits une fois avec du phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS) sans Mg 2 + et Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). La plaque peut être laissé dans la hotte de culture cellulaire pour quelques heures. </li><li> Pour chaque puits d'une plaque de 96 puits, diluer dans un tube de 1,5 ml Eppendorf 0,2 pg d'ADNc dans 25 ul OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Intensifier proportionnellement selon le nombre de puits à être transfectées par l'ADNc mêmes. Aussi diluer dans un séparées de 1,5 ml tube Eppendorf 0,4 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) dans 25 ul OPTI-MEM pour chaque puits à transfecter. Échelle de cette place en fonction du nombre total de puits à transfecter. </li><li> Brièvement au vortex de 2000 diluée ADNc et Lipofectamine et laissez-les reposer à la température ambiante pendant environ 5 min. </li><li> Transférer un volume égal de la Lipofectamine diluée 2000 sur le tube qui contient l'ADNc dilué, vortex et laisser reposer le mélange à la température ambiante pendant 15 min à 2 heures. Pendant ce temps, le transfert de l'ADNc / Lipofectamine 2000 mélange à 49 ul / puits de la plaque de poly-L-ornithine couché. </li><li> Trypsiniser les cellules HEK293 (étape 1.1), comte de densité cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre ou contre la comtesse de cellules automatisé (Invitrogen, C10227), et de transférer une quantité désirée de cellules (généralement environ ~ 125,000-150,000 cellules / puits) d'une solution stérile de 15 ml tube à centrifuger conique à fond. Centrifuger à 1000 RPM x pendant 5 min. Resuspendre les cellules à ~ 1,250,00-1,500,000 cellules / ml dans le milieu de culture DMEM, supplémenté avec 10% inactivés par la chaleur du sérum de veau fœtal, mais sans antibiotiques. </li><li> Distribuer 98 suspension cellulaire ul à chaque puits qui contient l'ADNc-Lipofectamine 2000 en utilisant un mélange de pipetteur multicanaux ou le distributeur de microplaques MicroFill (Bio-Tek). Laissez reposer la plaque dans la hotte pendant au moins 30 min avant de le placer à l'humidifié incubateur de culture cellulaire. Incuber à 37 ° C CO, 5% pour les 20-44 2 heures. </li></ol> Pour les cellules HEK293 exprimant de façon stable TRPA1 <ol start="8"><li> Suivez l'étape 1.2 pour enduire les plaques 96 puits. </li><li> La ligne inductible de cellules HEK293-hTRPA1 a été généreusement fourni par le Dr A. Patapoutian (Le Scripps Research Institute) et maintenu dans le même milieu que les HEK293 cellules de type sauvage (étape 1.1), mais supplémenté avec 5 pg / ml blasticidine (Invitrogen, A1113902) et 50 pg / ml d'hygromycine B (Invitrogen, 10687010). Lorsque la densité cellulaire atteint environ 90%, trypsiniser cellules, comptez densité cellulaire, et centrifuger la quantité désirée de cellules à 1000 x RPM pendant 5 min. Resuspendre les cellules à une densité de ~ 1.000.000 cellules / ml dans le même milieu de culture complété par la doxycycline (Fisher, BP26535, 0,25 pg / ml). </li><li> Répartir la suspension cellulaire à la poly-L-ornithine plaques revêtues à 100 l / puits en utilisant un pipetteur multicanaux ou l'MicroFill (Bio-Tek). Laissez reposer la plaque dans la hotte pendant au moins 30 min avant de le placer à l'humidifié incubateur de culture cellulaire. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pour 16 - 24 heures. </li></ol> 2. Solutions <ol><li> Une solution de Hank saline tamponnée (HBSS) est utilisé comme la solution extracellulaire. Il contient (en mM): 137 NaCl, KCl 5,4, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, CaCl 2 1,3, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 de glucose, 10 HEPES, avec un pH ajusté à 7,4 en utilisant NaOH 1N). </li><li> Fluo-4 contient un tampon d'essai de 2 mM de probénécide dans HBSS. Faire 250 mm Stock probénécide (Sigma, P8761) dans NaOH 0,5 N. Diluer à HBSS à un ratio de 1:125. Réajuster le pH à 7,4 à l'aide du HCl 1 N. </li></ol> 3. De chargement cellulaire avec Fluo-quatre heures <ol><li> Dissoudre 1 mg Fluo-quatre heures (Invitrogen, F14202) dans 912 ul de DMSO anhydre pour faire une solution de réserve de 1 mM. Le Fluo-quatre heures solution stock peut être conservé à -20 ° C pendant au moins un mois. </li><li> Mélanger 10 ul 1 mM Fluo-quatre heures avec 10 ul Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (p / v) solution dans le DMSO), puis transférer le contenu entier de 5 ml Fluo-4 tampon de dosage (étape 2.2) supplémenté avec 0,1% de sérumalbumine bovine (Sigma, A9418). </li><li> Laver les cellules cultivées en plaques 96 puits (étape 1.7 ou 1.10) avec HBSS à 80 ul / puits 2 fois en utilisant un laveur de microplaques (comme ELx405TM de Bio-Tek). </li><li> Ajouter le Fluo-4 AM chargement solution (étape 3.2) à 50 pl / puits en utilisant un pipetteur multicanaux ou l'MicroFill (Bio-Tek) et incuber la plaque à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Laver les cellules trois fois avec le tampon de dosage Fluo-4 (étape 2.2.) En utilisant le laveur de microplaques ELx405TM. Après le dernier lavage, laisser 80 ul du tampon de dosage Fluo-4 dans chaque puits. </li></ol> 4. Préparation de la plaque de composés <ol><li> Pendant la période de 1 heure de chargement de cellules, de préparer une série de dilutions 3x d'agonistes (ou antagonistes) de 3x de la concentration finale souhaitée dans la mémoire tampon de Fluo-4 dosage. </li><li> Pipeter 250 à 300 pl de la solution diluée composé d'une plaque composé de 96 puits. Arrangez-vous pour avoir le dilutions en série d'un composé et les contrôles positifs et négatifs correspondants dans la même colonne de la plaque composé chaque fois qu'il est possible parce que Flexstation 3 lit une seule colonne à la fois. </li></ol> 5. Lecture des plaques dans les trois Flexstation <ol><li> Allumez le système (Flexstation 3, l'ordinateur et le logiciel de SoftMax Pro 5.2) </li><li> Enregistrer l'expérience avec un nouveau nom. Lors de la mise en place, choisissez le mode FLEX et entrez les valeurs suivantes: </li></ol> Protocole n ° 1, l'effet agoniste <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="Tableau 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tableau 1"> Protocole n ° 2, effet antagoniste <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="Tableau 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tableau 2"><ol start="3"><li> Placez une zone nouvelle astuce, plaque composé et la plaque de lecture pour les bacs appropriés dans Flexstation 3 et cliquez sur "lire" le bouton. Le Flexstation 3 va lire une colonne à la fois et d'ajouter des composés au niveau des points de temps préprogrammés sans interrompre la lecture. Il faut environ 3 minutes (5 min pour le protocole n ° 2) pour terminer la lecture d'une colonne et la machine va continuer à lire la colonne suivante avec des ajouts effectués composé tel que programmé par l'utilisateur dans l'étape 5.2 jusqu'à ce que toutes les colonnes sont lues. </li></ol> 6. L'analyse des données <ol><li> Les données expérimentales peuvent être traitées directement en utilisant les SoftMax Pro 5.2 logiciel ou copié et collé dans n'importe quel tableur comme Microsoft Excel. Courbe concentration-réponse d'un acide TRPA1 agoniste flufénamique (FFA) est construit en utilisant la routine d'ajustement suivant les moindres carrés. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="Équation 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Équation 1"> , Où Y est la réponse observée, Y max est la réponse normalisée maximale, C est la concentration du médicament correspondant, CE 50 est la concentration qui évoque une réponse semi-maximale, et n H est le coefficient de Hill apparente. Concentration d'inhibition de la courbe pour une putative TRPA1 composé antagoniste A est obtenu en utilisant une concentration fixe de la FFA (100 uM), et en augmentant progressivement la concentration du composé A. CI 50 du composé A est calculé par moindres carrés montage de ce qui suit équation. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="Équation 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Équation 2"> , Où Y est la réponse observée et Y max est normalisé la réponse maximale, [Ant] est le composé correspondant Une concentration, IC 50 est la concentration antagoniste qui produit des demi-inhibition maximale de la FFA-réponse évoquée, et n H est la Colline apparente coefficient. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: TRPA1 est un canal Ca 2 + cation-perméable, l'activation de ce qui conduit à un afflux de calcium qui peuvent être détectés par le Ca 2 + sensibles au colorant, Fluo-4 (1-2). Une lignée cellulaire HEK293-hTRPA1 stable a été utilisé pour étudier les relations concentration-réponse de TRPA1 agonistes et antagonistes. Les cellules ont été chargées avec Fluo-quatre heures, placées dans 80 ul du tampon de dosage, et lire l'aide Flexstation 3. Après l'enregistrement de la fluorescence de base pour 30 s, 40 pi d'une dilution en série de l'agoniste TRPA1, FFA, chacun à 3x sur la concentration finale désirée, ont été ajoutés à des cellules à travers un pipetteur multicanaux inclus comme une partie du module fluidique des Flexstation 3. Les changements de fluorescence ont été suivis pendant une supplémentaire de 180 s. Les changements relatifs Fluo-4 de fluorescence de chaque puits ont été exprimés en AF = (F - F 0), où 0 F et F sont des valeurs de fluorescence à la fois de l'intérêt et le début de la lecture, respectivement. Représentant des traces des cours du temps pour les changements de fluorescence en réponse à une série de concentrations FFA sont présentés sur la Fig. 1. Note pour les concentrations dernière FFA quatre, bien que les niveaux de réponse maximal sont similaires, la cinétique d'activation est nettement plus rapide à la plus élevée que pour les concentrations inférieures FFA. Par conséquent, pour distinguer ces différences, la concentration - relation dose-réponse a été construite en mesurant les taux initiaux (pente) de l'augmentation de fluorescence lors de l'addition de concentrations variables de la FFA (Fig. 2). L'effet maximal moitiéla concentration IVE (CE 50) de la FFA a été établi à 55,4 uM (n = 3). Pour tester la putatifs TRPA1 antagoniste, le composé A, nous avons réalisé une expérience similaire en utilisant le protocole n ° 2 (étape 2). Dans ce cas, une série de dilutions de l'antagoniste ont été ajoutés à 30 s (40 pi de 3x désiré concentrations finales) et la FFA a été ajouté plus tard, 180 s (60 pi à 300 uM pour une concentration finale de 100 uM). Composé A dose-dépendante réduit la réponse de l'TRPA1 cellules à la FFA avec une concentration maximale moitié inhibitrices (CI 50) de 4,3 uM (n = 3) (Fig. 2). <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Concentration-dépendante l'activation de TRPA1 humaine par la FFA. Les traces sont plus évoqués FFA de la fluorescence au cours du temps (réponses uniquement dans les 60 premières secondes sont présentés pour mieux illustrer la cinétique rapide de la FFA-réponses évoquées). S'il vous plaît noter que des concentrations plus élevées FFA évoqué augmentation de fluorescence avec un. Beaucoup plus rapide que les cinétiques des concentrations plus faibles, même si les niveaux de crête de fluorescence ont été similaires <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 Concentration -. Relations de réponse pour le changement induit par la FFA fluorescence et composé A induit une inhibition de la réponse de la FFA dans le TRPA1 humaine exprimée de façon stable dans les cellules HEK293. Δ, la concentration - relation dose-réponse du FFA a été déterminée en mesurant le taux initial (pente) de l'augmentation de la fluorescence normalisée lors de l'addition de concentrations variables de la FFA. O, relation concentration-réponse de l'inhibition de la FFA-réponse évoquée du calcium par une putative TRPA1 antagoniste, composé A.

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<li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Intracellulaire de Ca 2 + joue un rôle important dans de nombreuses conditions physiologiques et pathologiques, tels que libération des neurotransmetteurs (3), le potentiel d&#39;action cardiaque (4), la contraction des cellules musculaires (5), la transduction du signal cellulaire (6-7), et la mort cellulaire excitotoxique ( 8). Mesure de Ca 2 + intracellulaire niveaux aide à élucider les changements fonctionnels de Ca 2 +-canaux perméables dans la membrane plasmique ou organites intrac...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Flexstation 3 </td><td> Molecular Devices </td><td> Flex3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Eh bien, embouts de pipettes Flexstation </td><td> Molecular Devices </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques de 96 puits </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Eh bien clair plaques à fond plat </td><td> Costar </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-quatre heures </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-ornithine </td><td> Sigma </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> probénécide </td><td> Sigma </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;albumine sérique bovine </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

essai de calcium à base de cellules pour les moyennes et criblage à haut débit fonctions de canaux trp utilisant flexstation 3

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Flexstation La Molecular Devices &#39;3 est une paillasse multi-mode lecteur de microplaques capable de mesure de la fluorescence automatisé plaques multi-puits. Elle est idéale pour les moyennes et à haut débit écrans dans les milieux universitaires. Il dispose d&#39;un module de transfert de fluide intégré équipé d&#39;un pipetteur multi-canal et la machine lit une colonne à la fois de surveiller les changements de fluorescence d&#39;une variété de réactifs fluorescents. Par exemple, Flexstation 3 a été utilisé pour étudier la fonction de Ca 2 +-perméable canaux ioniques et G récepteurs couplés aux protéines en mesurant les changements de libre intracellulaire de Ca 2 + niveaux. Transitoire des récepteurs potentiels (TRP) des canaux sont une grande famille de canaux cationiques non sélectifs qui jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques et physiopathologiques. La plupart des canaux TRP sont perméables de calcium et d&#39;induire l&#39;influx de calcium lors de l&#39;activation. Dans cette vidéo, nous démontrons l&#39;application de Flexstation 3 pour étudier le profil pharmacologique de la voie TRPA1, un capteur moléculaire pour de nombreux stimuli nocifs. Cellules HEK293 exprimant de façon stable ou transitoire humaine TRPA1 canaux, cultivés dans des plaques 96 puits, sont chargés avec un Ca 2 + sensibles au colorant fluorescent, Fluo-4, et en temps réel les changements de fluorescence de ces cellules sont mesurés avant et pendant l&#39;application de la un agoniste TRPA1 utilisant le mode FLEX de l&#39;Flexstation 3. L&#39;effet d&#39;une putative TRPA1 antagoniste a été également examiné. Les données sont transférées à partir du logiciel Pro SoftMax de construire des relations concentration-réponse du TRPA1 activateurs et inhibiteurs.

Cette vidéo fournit un protocole détaillé pour l&#39;étude du profil pharmacologique de canaux à l&#39;aide humaine TRPA1 Flexstation 3. Le protocole couvre les détails de préparation de cellules, le colorant de charge et le fonctionnement du lecteur de microplaques, Flexstation 3.

Essai de calcium à base de cellules pour les moyennes et criblage à haut débit fonctions de canaux TRP utilisant Flexstation 3

Le FlexStation 3 de Molecular Devices est un lecteur de microplaques multimode de paillasse capable d'effectuer des mesures de fluorescence automatisées dans des plaques multi-puits. Il est...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer l'utilisation du Flex Station trois pour étudier le profil pharmacologique du canal du récepteur potentiel transitoire, ou canal TRPA1. Cela est réalisé en préparant d'abord des cellules exprimant des canaux TRPA1 dans des plaques de microtitration de 96 puits.Après lavage des cellules à l’aide d’un laveur de microplaque, les cellules sont chargées avec le colorant fluorescent sensible au calcium. Flu oh 4:00 AM Une période de chargement cellulaire est ensuite suivie par plusieurs lavages supplémentaires. L’étape suivante de la procédure consiste à préparer la plaque de composés, incluant un agoniste trip, a un et un antagoniste putatif trip, a un.En dernière étape, les paramètres du logiciel sont configurés pour la lecture de la plaque sur le système Flex Station trois. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les relations dose-réponse concernant l'activation de trip A un par l'acide flu phonémique, ainsi que l'inhibition par le composé antagoniste A. Bien que cette méthode permette d'obtenir des informations sur les mécanismes d'activation de 21 en mesurant l'entrée de calcium, elle peut également être appliquée à l'étude des fonctions d'autres canaux oculaires perméables au calcium et de récepteurs couplés aux protéines G, en utilisant des colorants congelés sensibles au calcium ou des colorants de potentiel membranaire.L'avantage principal de cette méthode par rapport aux techniques existantes telles que l'imagerie calcique et le cartographiage manuel par patch est qu'elle permet un criblage à haut débit de la fonction et de la modulation des formules calciques, des canaux ferriques et d'autres récepteurs mobilisateurs de Ca, tout en économisant du temps. Avant le début de ce protocole, cultiver des cellules HEC 293 stablement transfectées avec la trip A un à une densité de 70 à 90 %, comme décrit dans le protocole écrit. Pour commencer la préparation des cellules destinées au test calcique, recouvrir des plaques de 96 puits en pipetant 50 microlitres de poly-L-ornithine dans chaque puits, puis incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes.Après l'incubation, rincer les cellules une fois avec le tampon phosphate salin de KO. Après la trypsine, transférer la quantité souhaitée de cellules HEC 2 93 dans un tube conique stérile de 15 millilitres et centrifuger l'échantillon. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire obtenu.Dans le milieu de culture DMEM supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, distribuer 100 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque 96 puits. À l’aide d’une pipette multipuits, laisser la plaque reposer dans la hotte pendant au moins 30 minutes avant de la placer dans l’incubateur de culture cellulaire humidifié pendant 20 à 44 heures. Pour la préparation du dosage du calcium, préparer d’abord les solutions comme décrit dans le protocole écrit.Une fois préparé, mélanger 10 microlitres d'une solution de fluoh 4:00 AM à une millimolaire avec 10 microlitres d'onic. F1 27, puis transférer la totalité du contenu dans 5 millilitres de tampon de dosage flu. Oh quatre supplémenté avec 0,1 % d'albumine sérique bovine.Ensuite, lavez les cellules cultivées dans des plaques 96 puits avec du HBSS à 80 microlitres par puits, deux fois, à l’aide d’un laveur de microplaque. Après le lavage, ajoutez la solution de chargement fluo-4 AM à 50 microlitres par puits à l’aide d’une pipette multicanal et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant cette période de chargement cellulaire d’une heure, préparez une série de solutions triplées d’agonistes, une série de solutions triplées d’antagonistes, et un grand volume d’agoniste à 300 micromolaire dans le tampon de dosage fluo-4.300 microlitres des solutions de composé diluées dans une plaque de composés à 96 puits. Organisez les dilutions sérielles d'un composé ainsi que les contrôles positif et négatif correspondants dans la même colonne de la plaque de composés chaque fois que possible. Étant donné que le Flex Station Three lit une seule colonne à la fois, pipetez 300 microlitres de la solution d'agoniste à 300 micromolaire à côté de chaque puits contenant l'antagoniste, comme étape finale de préparation cellulaire.Lavez les cellules chargées trois fois avec le tampon acide flu oh quatre en utilisant le laveur de microplaque après le dernier lavage. Laissez 80 microlitres de tampon acide flu oh quatre dans chaque puits. Pour commencer la lecture de la plaque, allumez le système Flex Station trois et lancez le logiciel Soft Max Pro 5.2.Enregistrez l'expérience sous un nouveau nom de fichier lors de la configuration. Choisissez le mode flex et saisissez les paramètres permettant de mesurer l'effet agoniste et antagoniste, tels qu'indiqués dans la procédure écrite. Ensuite, placez une nouvelle boîte de pointes, la plaque de composés et la plaque de lecture dans les plateaux appropriés de la station flex.Three.Commencez la lecture de la plaque en cliquant sur le bouton de lecture dans le logiciel Soft Max Pro. Le Flex Station trois lira une colonne à la fois et ajoutera les composés aux points temporels préprogrammés sans interrompre la lecture. Une fois l'analyse terminée, les données expérimentales peuvent être traitées directement à l'aide du logiciel Soft Max PRO ou copiées et collées dans n'importe quel tableur tel que Microsoft Excel.Pour analyser les données, générez des courbes de réponse en fonction de la concentration pour l'agoniste trip a one, l'acide flu phonémique, et pour le composé putatif antagoniste de trip a one, le composé A, en utilisant un ajustement aux moindres carrés comme décrit dans la procédure écrite trip. Trip a one est un canal cationique perméable au calcium dont l'activation entraîne une entrée de calcium pouvant être détectée par le colorant sensible au calcium flu oh 4:00 AM. Des tracés représentatifs des cinétiques des variations de fluorescence en réponse à une série de concentrations d'acide flu phonémique ou de FFA sont présentés à des concentrations plus élevées. La FFA induit des augmentations de fluorescence avec une cinétique beaucoup plus rapide qu'à des concentrations plus faibles, malgré des niveaux de fluorescence maximale similaires.Pour distinguer ces différences, la relation concentration-réponse a été établie en mesurant les vitesses initiales de l'augmentation de la fluorescence. Après l'ajout de concentrations variables d'AGL, la concentration efficace maximale demi (CE50) d'AGL a été déterminée à 55,4 micromolaire. La relation concentration-réponse d'inhibition de la réponse calcique induite par l'AGL par un composé antagoniste putatif du récepteur TRPA1, le composé A, est également présentée.Une dose a réduit indépendamment la réponse des cellules triple A un à l'acide gras libre avec une concentration inhibitrice maximale à moitié de 4,3 micromolaire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier les profils pharmacologiques des canaux triple A un et apparentés en utilisant le système Flag Station Trois.

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