Imagerie à haute résolution des récepteurs de neurotransmetteurs au niveau des synapses rétiniennes

Prenez une coupe rétinienne de souris sur une grille de microscopie électronique. La section contient des cellules ganglionnaires rétiniennes, ou CGR, liées synaptiquement aux cellules bipolaires. Les

cellules bipolaires présynaptiques contiennent des vésicules de neurotransmetteurs disposées en forme de ruban près de la membrane synaptique.

Les

CGR postsynaptiques présentent des récepteurs de neurotransmetteurs regroupés sur leur membrane. Ces cellules sont marquées avec la toxine cholérique sous-unité B ou CTB.

Laver avec un tampon pour maintenir le pH.

Incuber avec un tampon de blocage pour masquer les sites de liaison non spécifiques.

Incuber avec des anticorps primaires ciblant les récepteurs des neurotransmetteurs et le CTB.

Laver avec un tampon pour éliminer les anticorps non liés et maintenir le pH.

Incuber avec des anticorps secondaires conjugués à des nanoparticules d’or de différentes tailles, qui se lient aux anticorps primaires, marquant les molécules cibles.

Retirez les anticorps non liés, puis séchez l’échantillon à l’air.

Appliquez des métaux lourds qui lient les macromolécules, améliorant ainsi le contraste.

À l’aide de la microscopie électronique, identifiez les CGR à l’aide des CTB marqués et localisez les récepteurs de neurotransmetteurs marqués.

Dans cette étape, coupez des sections ultra-minces de 70 nanomètres d’épaisseur à l’aide d’un ultramicrotome et collectez-les sur les grilles de nickel recouvertes de carbone Formvar. Lavez les grilles à l’eau distillée une fois, puis trois lavages de TBS. Ensuite, incubez les grilles dans 20 microlitres de BSA à 5 % dans du TBS pendant 30 minutes, puis dans 20 microlitres d’un mélange contenant de l’anti-CTB de chèvre et un anticorps contre une sous-unité NMDAR pendant la nuit à température ambiante.

Après cela, lavez les grilles trois fois avec 20 microlitres de TBS à chaque fois à pH 7,6. Par la suite, lavez une fois les grilles avec du TBS à pH 8,2 pendant cinq minutes. Incuber les grilles pendant deux heures avec 20 microlitres d’un mélange contenant des IgG anti-lapin d’âne, couplées à des particules d’or de 10 nanomètres, et des IgG anti-chèvre d’âne couplées à des particules d’or de 18 nanomètres.

Après deux heures, lavez trois fois les grilles dans 20 microlitres de TBS à pH 7,6, puis les laver dans de l’eau ultrapure. Ensuite, faites sécher les grilles à l’air. Ensuite, contre-colorez les grilles avec de l’acétate d’uranyle à 5 % dans de l’eau distillée pendant huit minutes, puis avec du citrate de plomb à 0,3 % dans de l’eau distillée pendant cinq minutes dans l’obscurité.